{"id":253,"date":"2014-01-16T13:11:57","date_gmt":"2014-01-16T12:11:57","guid":{"rendered":"http:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/?page_id=253"},"modified":"2025-11-12T09:43:03","modified_gmt":"2025-11-12T08:43:03","slug":"chapitre-1","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/chapitre-1\/","title":{"rendered":"Chapitre 1"},"content":{"rendered":"

Voir les cellules et leur contenu<\/b><\/span><\/h2>\n

<\/a>Le microscope optique<\/b><\/span><\/h4>\n

La cytologie est la branche de la biologie consacr\u00e9e \u00e0 l\u2019\u00e9tude de la structure et des fonctions des cellules ; elle proc\u00e8de par l\u2019examen microscopique de coupes de tissus fix\u00e9es et color\u00e9es. L\u2019\u0153il humain est un organe que l\u2019on peut assimiler \u00e0 un instrument d\u2019optique. Son pouvoir de r\u00e9solution est de 200 microm\u00e8tres. Les cellules, dont la taille est g\u00e9n\u00e9ralement comprise entre 10 et 20 microm\u00e8tres, ne sont pas observables \u00e0 l\u2019\u0153il nu. Leur examen n\u00e9cessite le recours \u00e0 un outil, le microscope optique, apparu au d\u00e9but du XVIIe<\/sup> si\u00e8cle et perfectionn\u00e9 au XIXe<\/sup>. C\u2019est \u00e0 cette \u00e9poque que la cytologie s\u2019individualisa en une branche autonome de la biologie.<\/p>\n

Le pouvoir grossissant des lentilles de verre convexes \u00e9tait connu depuis l\u2019Antiquit\u00e9. Dans un trait\u00e9 r\u00e9dig\u00e9 au IIe<\/sup> si\u00e8cle \u00e0 Alexandrie, Claudius Ptol\u00e9m\u00e9e abordait les probl\u00e8mes de r\u00e9flexion et de r\u00e9fraction des rayons lumineux. Les premiers microscopes apparurent au XVIIe<\/sup> si\u00e8cle, en m\u00eame temps que les premi\u00e8res lunettes astronomiques. A la base, le principe est le m\u00eame : il faut disposer de mani\u00e8re ad\u00e9quate des lentilles dans un tube. Au XIIIe<\/sup> si\u00e8cle, V\u00e9nitiens et Florentins vendaient des lunettes pour corriger la myopie ou la presbytie et, vers 1450, ils commenc\u00e8rent \u00e0 ma\u00eetriser l\u2019assemblage de lentilles biconcaves. Si l\u2019on se pose la question de savoir qui a invent\u00e9 le microscope, il semble que dans le milieu des polisseurs de lentilles et des fabricants de lunettes qui prosp\u00e9rait aux Pays-Bas \u00e0 la fin du XVIe<\/sup> si\u00e8cle et au d\u00e9but du XVIIe<\/sup>, Zacharias Janssen et son fils Hans aient jou\u00e9 un r\u00f4le pr\u00e9pond\u00e9rant. Ils auraient dispos\u00e9 d\u00e8s 1590 des lentilles dans un tube et constat\u00e9 que cet assemblage permettait d\u2019obtenir un grossissement des objets examin\u00e9s. Le microscope construit en 1595 \u00e9tait form\u00e9 de deux lentilles dans des tubes coulissants ; le grossissement obtenu \u00e9tait de 10 X. L\u2019on a retrouv\u00e9 la trace \u00e9crite de querelles de priorit\u00e9 et d\u2019ant\u00e9riorit\u00e9 des brevets, les h\u00e9ritiers de Zacharias Janssen ayant intent\u00e9 une action en justice pour faire reconna\u00eetre l\u2019ant\u00e9riorit\u00e9 de sa d\u00e9couverte. En 1655, \u00e0 la lumi\u00e8re des r\u00e9sultats de l\u2019enqu\u00eate men\u00e9e par les autorit\u00e9s de Middelburg, celles-ci accr\u00e9dit\u00e8rent le r\u00f4le des Zacharias p\u00e8re et fils dans la d\u00e9couverte du microscope (terme qui n\u2019apparut qu\u2019au milieu du XVIIe<\/sup> si\u00e8cle).<\/p>\n

Des lunettes d\u2019observation et des microscopes furent construits et propos\u00e9s aux amateurs par Jacob Metius, d\u2019Alkmaar, Hans (ou Johann) Lippershey, de Middelburg, ou Cornelis Jacobszoon Drebbel. L\u2019occhiolino de Galileo Galilei, dit Galil\u00e9e (1609) comprenait une lentille convergente et une lentille divergente. Des microscopes furent con\u00e7us en 1618 par l\u2019astronome Francesco Fontana ; en 1646, par le professeur de physique et de math\u00e9matiques Athanasius Kircher (Coll\u00e8ge romain). Robert Hooke commen\u00e7a par construire un microscope comportant des lentilles convergentes dans un tube en bois, avant de confier la construction de ses microscopes \u00e0 l\u2019opticien londonien Christopher Cock. L\u2019objet, \u00e9clair\u00e9 par la lumi\u00e8re d\u2019une lampe \u00e0 huile, condens\u00e9e par des loupes, \u00e9tait grossi de 30 \u00e0 50 X.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Kircher A Ars magna Lucis et Umbrae<\/i> (1646)<\/p>\n

A partir du XVIIe<\/sup> si\u00e8cle, le microscope optique allait \u00eatre le seul outil d\u2019investigation des amateurs de Sciences Naturelles. Il en existait de deux sortes : le microscope simple (une loupe) et le microscope compos\u00e9, dont l\u2019aspect nous est familier : un tube m\u00e9tallique muni \u00e0 son extr\u00e9mit\u00e9 inf\u00e9rieure d\u2019une lentille servant d\u2019objectif ; \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 sup\u00e9rieure une autre lentille fait office d\u2019oculaire ; un condenseur focalise la lumi\u00e8re (autrefois, celle d\u2019une bougie ou d\u2019une lampe \u00e0 huile) sur l\u2019objet \u00e0 examiner. Les d\u00e9fauts des premiers microscopes compos\u00e9s \u00e9taient tels que les Naturalistes en abandonn\u00e8rent l\u2019usage peu apr\u00e8s sa d\u00e9couverte ; le flou des images observ\u00e9es les rendait inutilisables. Avec des connaissances en optique g\u00e9om\u00e9trique limit\u00e9es et largement empiriques, en particulier en ce qui concerne la r\u00e9fraction (la d\u00e9viation subie par un rayon lumineux passant d\u2019un milieu transparent \u00e0 un autre), le probl\u00e8me de la correction des aberrations des lentilles ne risquait pas de trouver de solution. D\u2019autre part, les microscopes manquaient de stabilit\u00e9 et pr\u00e9sentaient des d\u00e9fauts d\u2019alignement du dispositif optique ; en effet, l\u2019oculaire et l\u2019objectif \u00e9taient ins\u00e9r\u00e9s dans des supports de bois ou de carton manquant de rigidit\u00e9. Le probl\u00e8me fut partiellement r\u00e9solu par l\u2019emploi de tubes de cuivre. Au cours du XVIIIe<\/sup> si\u00e8cle, les Naturalistes utilis\u00e8rent donc surtout des microscopes monoculaires dont les grossissements \u00e9taient sup\u00e9rieurs \u00e0 ceux atteints avec le microscope compos\u00e9, si l\u2019on en juge par les performances des instruments fabriqu\u00e9s par Antonie van Leeuwenhoek qui sont parvenus jusqu\u2019\u00e0 nous.<\/p>\n

Parti de la loupe utilis\u00e9e par les drapiers pour \u00e9valuer la qualit\u00e9 des tissus \u2013 le compte-fils -, van Leeuwenhoek en am\u00e9liora consid\u00e9rablement les performances. Il avait appris \u00e0 polir les lentilles aupr\u00e8s de Johannes Huddle, qui fut aussi le ma\u00eetre de son contemporain Jan Swammerdam, pionnier de l\u2019examen microscopique des \u00eatres vivants. Leeuwenhoek acquit dans ce domaine une exceptionnelle habilet\u00e9, polissant des jours durant un larme de verre avec des m\u00e9langes de poudres de sa composition. Des centaines de microscopes qu\u2019il construisit durant sa longue vie (il mour\u00fbt \u00e0 90 ans !), ceux qui existent encore se trouvent dans les mus\u00e9es et les collections de soci\u00e9t\u00e9s savantes. Ils sont \u00e9quip\u00e9s d\u2019une lentille biconvexe \u00e0 tr\u00e8s courte distance focale ne pr\u00e9sentant pas d\u2019aberration chromatique ! (voir plus loin). Ces microscopes se pr\u00e9sentent sous la forme d\u2019une double plaque de cuivre perc\u00e9e d\u2019un trou dans lequel est log\u00e9e la lentille ; face \u00e0 cette ouverture, une pointe m\u00e9tallique sur laquelle \u00e9tait fix\u00e9 l\u2019\u00e9chantillon \u00e0 observer est mue par une vis permettant d\u2019ajuster sa position face \u00e0 la lentille et \u00e0 l\u2019\u0153il de l\u2019observateur. Les observations se faisaient \u00e0 la lumi\u00e8re du jour ou d\u2019une petite lampe \u00e0 p\u00e9trole. Certains de ces instruments permettent d\u2019atteindre des grossissements de 200 \u00e0 400 X ! une performance remarquable si l\u2019on songe que les grossissements obtenus avec les microscopes compos\u00e9s ne d\u00e9passaient pas 20 \u00e0 40 X ; il faudra attendre un si\u00e8cle et demi apr\u00e8s la disparition du g\u00e9nial Hollandais pour atteindre des performances \u00e9quivalentes avec des microscopes compos\u00e9s.<\/p>\n

Au cours de la premi\u00e8re moiti\u00e9 du XVIIe<\/sup> si\u00e8cle, les \u0153uvres de trois physiciens et math\u00e9maticiens, Willebrord Snell van Royen, Ren\u00e9 Descartes et Pierre de Fermat, firent progresser significativement les connaissances dans cette branche de la physique que l\u2019on appelle \u00ab optique g\u00e9om\u00e9trique \u00bb. Au d\u00e9part est l\u2019\u00e9nonc\u00e9 du principe de propagation en ligne droite de la lumi\u00e8re dans les milieux transparents. Les progr\u00e8s se firent dans trois domaines : (i) la r\u00e9flexion de la lumi\u00e8re : le changement de direction, sans changement de milieu, subit par un rayon lumineux qui rencontre une surface (miroir) ; (ii) la r\u00e9fraction de la lumi\u00e8re : le passage d\u2019un un rayon lumineux d\u2019un milieu homog\u00e8ne \u00e0 un autre milieu homog\u00e8ne donne naissance \u00e0 un rayon transmis et un rayon r\u00e9fl\u00e9chi ; (iii) la diffraction : l\u2019\u00e9talement de la lumi\u00e8re, qui se d\u00e9pla\u00e7ait en ligne droite, lorsqu\u2019elle rencontre un obstacle ou une ouverture de faible diam\u00e8tre. La contribution apport\u00e9e par Descartes est expos\u00e9e en partie dans l\u2019opuscule intitul\u00e9 \u00ab Dioptrique \u00bb, qu\u2019il a publi\u00e9 en 1637, en m\u00eame temps que son Trait\u00e9 ; il contenait des erreurs qui furent relev\u00e9es par Fermat. Snell van Royen apporta une contribution significative \u00e0 l\u2019\u00e9nonc\u00e9 des lois sur la diffraction ; ses r\u00e9sultats n\u2019ayant jamais \u00e9t\u00e9 publi\u00e9s de son vivant, les lois de Snell-Descartes furent popularis\u00e9es par le physicien Christian Huygens. La contribution de Fermat r\u00e9side essentiellement dans le principe fondamental de l’optique g\u00e9om\u00e9trique qui d\u00e9crit la forme du chemin optique d’un rayon lumineux : la lumi\u00e8re se propage d’un point \u00e0 un autre sur des trajectoires telles que la dur\u00e9e du parcours soit extr\u00e9male. Le \u00ab principe de Fermat \u00bb permet de retrouver la plupart des r\u00e9sultats de l’optique g\u00e9om\u00e9trique, en particulier les lois de la r\u00e9flexion sur les miroirs et les lois de la r\u00e9fraction portant sur le trajet de la lumi\u00e8re dans des milieux d’indices diff\u00e9rents (air et verre, par exemple).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Descartes R Discours de la m\u00e9thode pour bien conduire sa raison et chercher la v\u00e9rit\u00e9 dans les sciences (1637)
\nFermat P Methodus ad disquirendam maxim\u00e1m et minimam<\/i> (1637)
\nHuygens C Dioptrica<\/i> (1685)<\/p>\n

Malgr\u00e9 ces progr\u00e8s, un probl\u00e8me majeur l\u2019imitait l\u2019utilisation du microscope compos\u00e9 ; on n\u2019\u00e9tait pas encore parvenu \u00e0 corriger les d\u00e9fauts des lentilles appel\u00e9s \u00ab aberrations \u00bb ; ils provoquent d\u2019importantes distorsions de l\u2019image de l\u2019objet examin\u00e9. Pour rappel, s\u2019agissant d\u2019un instrument d\u2019optique, le terme \u00ab aberration \u00bb d\u00e9signe toute d\u00e9formation ou manque de nettet\u00e9 de l\u2019image du sp\u00e9cimen observ\u00e9. Une loi de Descartes stipule que les rayons lumineux issus d\u2019un objet ponctuel ne convergent que rarement en une image ponctuelle. L\u2019\u00e9cart entre l\u2019image id\u00e9ale et l\u2019image form\u00e9e par l\u2019instrument d\u2019optique constitue une aberration. Deux formes d\u2019aberrations sont particuli\u00e8rement g\u00eanantes : (i) l\u2019aberration sph\u00e9rique, la forme la plus courante d\u2019aberration g\u00e9om\u00e9trique, est inh\u00e9rente \u00e0 la g\u00e9om\u00e9trie des lentilles ; les rayons lumineux parall\u00e8les \u00e0 l\u2019axe optique et passant \u00e0 proximit\u00e9 du centre d\u2019une lentille convergente et ceux passant \u00e0 la p\u00e9riph\u00e9rie ne convergent pas en un m\u00eame point ; (ii) l\u2019aberration chromatique, ou achromatisme, se manifeste par l\u2019obtention de plusieurs images correspondant aux diff\u00e9rentes longueurs d\u2019onde de la lumi\u00e8re \u00e9clairant l\u2019objet examin\u00e9 ; in fine<\/i>, l\u2019observateur voit une image iris\u00e9e parce que l\u2019indice de r\u00e9fraction du verre des lentilles varie avec la longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re incidente, c\u2019est-\u00e0-dire avec les diff\u00e9rentes couleurs de l\u2019objet. M\u00eame dans le cas d\u2019un microscope photonique dont les lentilles ne souffrent d\u2019aucune aberration, nous savons depuis les travaux de Louis de Broglie que la nature ondulatoire de la lumi\u00e8re impose une limite au pouvoir s\u00e9parateur. Les ph\u00e9nom\u00e8nes de diffraction inh\u00e9rents aux dispositifs optiques font que l\u2019image d\u2019un point lumineux est un cercle dont la luminosit\u00e9 d\u00e9croit du centre vers la p\u00e9riph\u00e9rie.<\/p>\n

Malgr\u00e9 ses imperfections, le microscope optique fut l\u2019outil de pionniers comme le naturaliste Jan Swammerdam ou le ma\u00eetre drapier et fonctionnaire \u00e9chevinal Antonie van Leeuwenhoek, des contemporains du peintre Johan Vermeer, du philosophe Baruch Spinoza (qui assurait sa survie en polissant des lentilles) et du m\u00e9decin et anatomiste Reinier (Regnerus) de Graaf, d\u00e9couvreur des follicules ovariens chez les mammif\u00e8res. Van Leeuwenhoek \u00e9tait un habile polisseur de lentilles et constructeur de microscopes. La vocation scientifique de van Leeuwenhoek naqu\u00eet peut-\u00eatre au cours de son s\u00e9jour \u00e0 Londres, le seul voyage qu\u2019il fit hors des Pays-Bas, pendant lequel il aurait consult\u00e9 l\u2019ouvrage \u00e0 succ\u00e8s de Robert Hooke.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Hooke R Micrographia, or some physiological descriptions of minute bodies made by magnifying glasses with observations and inquiries thereupon<\/i> (1665)<\/p>\n

L\u2019aberration chromatique fut le premier d\u00e9faut \u00e0 \u00eatre corrig\u00e9. Au XVIIIe<\/sup> si\u00e8cle (1729), Chester M. Hall, juriste et fabricant de lunettes astronomiques, parvint \u00e0 combiner des lentilles achromatiques. Avant de quitter cette \u00e9poque, je dois signaler que le microscope binoculaire apparut apr\u00e8s 1722. Au XIXe<\/sup>si\u00e8cle, Joseph J Lister, quacker par conviction, marchand de vin par n\u00e9cessit\u00e9, amateur d\u2019optique et de sciences naturelles par inclination, soumit \u00e0 la Royal Society<\/i> un m\u00e9moire dans lequel il d\u00e9crivait la r\u00e9alisation d\u2019objectifs dont le chromatisme \u00e9tait r\u00e9duit. Il fabriqua des lentilles en combinant du verre optique flint<\/i> avec du verre crown<\/i> ; le premier, riche en plomb et en m\u00e9taux lourds provoque une forte dispersion de la lumi\u00e8re ; le second a un pouvoir dispersif plus faible. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Lister JJ On Some Properties in Achromatic Object-Glass Applicable to the Improvement of the Microscope<\/i> (1830)<\/p>\n

Dans le domaine de la microscopie, je dirai, en sch\u00e9matisant un peu, qu\u2019il y a un avant et un apr\u00e8s Giovanni Batista Amici. Au d\u00e9but du XIXe<\/sup> si\u00e8cle, les innovations apport\u00e9es par cet astronome et professeur de math\u00e9matiques \u00e0 l\u2019Universit\u00e9 de Mod\u00e8ne conduisirent \u00e0 l\u2019essor de l\u2019observation microscopique des tissus et des cellules, et \u00e0 la naissance d\u2019une nouvelle branche de la science : la Cytologie. En 1844, il fit, une tourn\u00e9e des capitales europ\u00e9ennes, en commen\u00e7ant par Paris, pour promouvoir un nouveau microscope dans lequel il \u00e9tait parvenu \u00e0 corriger partiellement les aberrations sph\u00e9riques et chromatiques. Apr\u00e8s la d\u00e9monstration faite \u00e0 Londres, et quatre ans avant de d\u00e9couvrir le noyau, Robert Brown acquit un microscope con\u00e7u selon les sp\u00e9cifications d\u2019Amici. Le microscope utilis\u00e9 par Theodor Schwann, dans le laboratoire de Johannes Peter M\u00fcller, fut construit par l\u2019opticien viennois Simon Pl\u00f6ssl selon les sp\u00e9cifications d\u2019Amici. La Th\u00e9orie cellulaire est l\u2019\u0153uvre de microscopistes. La contribution d\u2019Amici ne s\u2019arr\u00eata pas \u00e0 la construction de quelques 300 microscopes. En 1847, il introduisit l\u2019immersion de l\u2019objectif dans une huile transparente. En augmentant l’ouverture num\u00e9rique – ouverture grand angle \u2013 on augmente le pouvoir de r\u00e9solution et la luminosit\u00e9 de l’image, permettant ainsi l\u2019observation de nouveaux d\u00e9tails. D\u2019autres opticiens, au XIXe<\/sup> si\u00e8cle, rivalis\u00e8rent de savoir-faire et d\u2019ing\u00e9niosit\u00e9 pour produire des instruments performants : \u00e0 Vienne, Simon Pl\u00f6ssl, \u00e9l\u00e8ve de Friedrich von Voigtlaender, Georg Merz, en Bavi\u00e8re, \u00e9l\u00e8ve du physicien et opticien Joseph von Fraunhofer, Pistor & Schick, \u00e0 Berlin. Leurs instruments, pieusement conserv\u00e9s dans les mus\u00e9es et les collections, ont acquis le statut d\u2019\u0153uvres d\u2019art. En 1884, Ernst Abbe, Otto Schott et Carl Zeiss cr\u00e9\u00e8rent la verrerie Jenaer Glasswerke Schott & Geossen<\/i>. En 1889, en utilisant les verres fabriqu\u00e9s par Schott, Abbe con\u00e7ut un objectif apochromatique, c\u2019est-\u00e0-dire corrig\u00e9 des aberrations chromatique et sph\u00e9rique pour certaines longueurs d\u2019onde. <\/p>\n

Jusqu\u2019\u00e0 l\u2019or\u00e9e du XXe<\/sup> si\u00e8cle, les ann\u00e9es de progr\u00e8s, d\u2019innovations et de d\u00e9couvertes en Cytologie sont en grande partie l\u2019h\u00e9ritage d\u2019Amici. En 1900, une sorte de limite fut atteinte : les principaux organites subcellulaires avaient \u00e9t\u00e9 d\u00e9couverts ; il n\u2019y avait plus de progr\u00e8s significatifs \u00e0 attendre de la microscopie dans le domaine de l\u2019anatomie de la cellule. En cause, principalement la limitation impos\u00e9e par la longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re utilis\u00e9e. <\/p>\n

Le microscope optique \u00e0 transmission (ou microscope photonique) de base est \u00e9quip\u00e9 d\u2019une lentille \u00ab objectif \u00bb, qui agrandit l\u2019objet, et d\u2019une lentille \u00ab oculaire \u00bb. Les deux caract\u00e9ristiques d\u2019un microscope sont sa puissance optique et sa r\u00e9solution, c\u2019est-\u00e0-dire la distance minimum entre deux objets que l\u2019on peut distinguer l\u2019un de l\u2019autre. En 1873, le physicien Ernst Carl Abbe \u00e9tablit la formule permettant de calculer le pouvoir de r\u00e9solution d\u2019un instrument d\u2019optique :<\/p>\n

d = 0,61 \u03bb \/ n.sin \u03b1<\/span><\/p>\n

o\u00f9 d est la distance s\u00e9parant deux points donnant deux images distinctes, \u03bb, la longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re de la source, n l\u2019indice de r\u00e9fraction du milieu (il est de 1 dans le vide) et \u03b1 la demi-ouverture angulaire de l\u2019objectif. On peut augmenter la r\u00e9solution d\u2019un microscope en optimisant les trois variables : \u03bb, n, \u03b1. La r\u00e9solution \u00e9tant inversement proportionnelle \u00e0 la longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re incidente, on ne peut pas aller au-del\u00e0 de \u03bb = 400 nm (lumi\u00e8re violette). En ce qui concerne l\u2019ouverture num\u00e9rique (n sin \u03b1), l\u2019introduction d\u2019une goutte d\u2019huile d\u2019indice de r\u00e9fraction 1,56 entre l\u2019objectif et l\u2019objet augmente l\u2019indice de r\u00e9fraction, c\u2019est \u00e0 dire le rapport entre la vitesse de la lumi\u00e8re dans le milieu entre l\u2019\u00e9chantillon et l\u2019objectif, et la vitesse de la lumi\u00e8re dans l\u2019air. Abbe a introduit une grandeur essentielle en optique oculaire : le rapport entre la r\u00e9fraction et la dispersion, baptis\u00e9 en son honneur \u00ab nombre d\u2019Abbe \u00bb. Avec un microscope dont on a port\u00e9 l\u2019ouverture num\u00e9rique \u00e0 une valeur proche de 1,7, on atteint un grossissement de 2.500 X et une r\u00e9solution de 200 nm.<\/p>\n

Je reviendrai plus loin sur ce concept de limite th\u00e9orique de r\u00e9solution du microscope optique. Sous certaines conditions, cette limite peut \u00eatre franchie, comme l\u2019ont montr\u00e9 les physiciens Stefan W. Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G\u00f6ttingen<\/i>) et R. Eric Betzig (University of California, Berkeley<\/i>), et le physico-chimiste William E Moerner (IBM Research Division Almaden Research Center, San Jose, California<\/i>). Avec la \u00ab Microscopie par Mol\u00e9cule individuelle \u00bb (Single-molecule Microscopy<\/i>) d\u2019Eric Betzig et William Moerner, ou la \u00ab D\u00e9pl\u00e9tion par Emission stimul\u00e9e \u00bb (Stimulated Emission Depletion<\/i>) de Stefan Hell, la limite th\u00e9orique de r\u00e9solution a \u00e9t\u00e9 franchie. Hell, Betzig et Moerner ont re\u00e7u le prix Nobel de chimie 2014.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Betzig E, Harootunian A, Lewis A, Isaacson M Near-field diffraction by a slit: implications for superresolution microscopy<\/i> (1986)
\nBetzig E, Lewis A, Harootunian A, Isaacson M, Kratschmer E Near Field Scanning Optical Microscopy (NSOM): Development and Biophysical Applications<\/i> (1986)
\nMoerner WE, Kador L Optical detection and spectroscopy of single molecules in a solid<\/i> (1989)
\nHell SW, Wichmann J Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy<\/i> (1994)<\/p>\n

Toute observation microscopique requiert un traitement pr\u00e9alable de l\u2019\u00e9chantillon \u00e0 examiner. Au XVIIe<\/sup> si\u00e8cle, les techniques de fixation, coupe et coloration \u00e9taient rudimentaires. Chaque naturaliste poss\u00e9dait ses recettes et, le plus souvent, se gardait bien d\u2019en faire profiter ses confr\u00e8res ; de ce point de vue, van Leeuwenhoek ne fut pas en reste. Le vinaigre de vin \u00e9tait couramment utilis\u00e9 pour \u00ab fixer \u00bb les \u00e9chantillons biologiques ; ceux que l\u2019on voulait maintenir en survie \u00e9taient scell\u00e9s dans des capillaires en verre pour \u00e9viter l\u2019\u00e9vaporation (c\u2019est ainsi que van Leeuwenhoek observa le mouvement des infusoires). L\u2019ampoule contenant le sp\u00e9cimen \u00e9tait maintenue par une boule de cire \u00e0 la pointe d\u2019une tige filet\u00e9e, ce qui permettait de placer l\u2019objet \u00e0 la hauteur de l\u2019axe optique de la lentille et de l\u2019\u0153il. Les \u00e9chantillons fix\u00e9s devaient \u00eatre d\u00e9bit\u00e9s en coupes de faible \u00e9paisseur, car au-del\u00e0 d\u2019une certaine \u00e9paisseur de coupe le passage des rayons lumineux est entrav\u00e9. Van Leeuwenhoek \u00e9tait un virtuose du rasoir : il parvenait \u00e0 obtenir des coupes dont l\u2019\u00e9paisseur n\u2019exc\u00e9dait pas 100 microm\u00e8tres ! Cet autodidacte \u00e9tait dot\u00e9 d\u2019un esprit m\u00e9thodique, je dirai m\u00eame \u00ab scientifique \u00bb. Orphelin de bonne heure, et de condition modeste, il n\u2019avait pas eu le loisir de faire de longues \u00e9tudes. Lorsqu\u2019il se livrait \u00e0 ses observation microscopiques, il consignait soigneusement ses r\u00e9sultats par \u00e9crit : origine du pr\u00e9l\u00e8vement examin\u00e9, saison, temp\u00e9rature, \u00e9clairement. En outre, il adopta une attitude scientifique en faisant varier les conditions exp\u00e9rimentales de mani\u00e8re syst\u00e9matique. Introduit aupr\u00e8s de la Royal Society<\/i> de Londres par son compatriote Regnerus de Graaf, il y communiqua le r\u00e9sultat de ses observations dans 375 lettres agr\u00e9ment\u00e9es de dessins, bien qu\u2019il f\u00fbt un pi\u00e8tre dessinateur. Il envoya aussi 27 lettres \u00e0 l\u2019Acad\u00e9mie des Sciences de Paris. Van Leeuwenhoek ne connaissait pas le latin, la langue des \u00e9changes entre savants. Ses lettres en n\u00e9erlandais furent traduites en anglais et en latin par les membres de la Royal Society<\/i> et publi\u00e9es dans les Philosophical Transactions<\/i>, la revue cr\u00e9\u00e9e en 1665. Elles furent plus tard regroup\u00e9es et publi\u00e9es en quatre volumes sous le titre : \u00ab Arcana naturae ope et beneficio exquisitissorum microscopiorum detecta, variisque experimentis demonstrata ab Antonio a Leeuwenhoek<\/i> \u00bb.<\/p>\n

Note : Pour la r\u00e9daction de ce sous-chapitre je me suis en partie inspir\u00e9 du texte pr\u00e9sent\u00e9 par Albert Claude au Symposium on Electron Microscopy<\/i>, qui s\u2019est tenu \u00e0 Modena<\/i>, en avril 1963.<\/p>\n

Le microscope \u00e0 contraste de phase<\/b><\/span><\/h4>\n

Comme son nom l\u2019indique, le microscope \u00e0 contraste de phase exploite les changements de phase d\u2019un faisceau lumineux traversant l\u2019objet \u00e0 observer, par rapport \u00e0 un faisceau lumineux de r\u00e9f\u00e9rence. Le principe en a \u00e9t\u00e9 invent\u00e9 en 1932 par Frederik Zernike (Rijksuniversiteit Groningen<\/i>, prix Nobel de physique 1953) ; son application \u00e0 la microscopie, en 1941, est l\u2019\u0153uvre d\u2019August K.J.V. K\u00f6hler (Carl Zeiss AG, I\u00e9na), l\u2019inventeur de l\u2019illuminateur qui porte son nom, et qui a r\u00e9volutionn\u00e9 le mode d\u2019\u00e9clairement de l\u2019objet. Ce microscope \u00e0 transmission permet l\u2019observation d\u2019objets non color\u00e9s, transparents et de faible \u00e9paisseur, par exemple des tissus ou des cellules \u00e9tal\u00e9es sur un support solide transparent. Les diff\u00e9rentes structures cellulaires \u2013 noyau, organites, cytosol \u2013 ont des indices de r\u00e9fraction l\u00e9g\u00e8rement diff\u00e9rents. Je rappelle que la vitesse de la lumi\u00e8re varie en fonction de l\u2019indice de r\u00e9fraction du milieu ; elle diminue lorsque l\u2019indice augmente. Devant la source lumineuse est plac\u00e9 un condenseur dont le plan focal est occup\u00e9 par un diaphragme annulaire ; un anneau dit \u00ab de phase \u00bb occupe le plan focal de l\u2019objectif. Le c\u00f4ne de lumi\u00e8re issu de l\u2019anneau circulaire du condenseur est superpos\u00e9 \u00e0 un anneau de taille similaire issu de l\u2019anneau de phase de l\u2019objectif \u2013 qui cr\u00e9e une diff\u00e9rence de phase d\u2019un quart de longueur d\u2019onde. La recombinaison du faisceau qui a travers\u00e9 l\u2019\u00e9chantillon avec un faisceau de r\u00e9f\u00e9rence provoque des interf\u00e9rences. Les diff\u00e9rences d\u2019indices de r\u00e9fraction entre structures cellulaires se traduisent par un d\u00e9calage de phase du faisceau lumineux qui les traverse. Ce changement de phase n\u2019est pas perceptible par l\u2019\u0153il humain ; pour l\u2019observer on le transforme en diff\u00e9rences d\u2019amplitude (transformation de l\u2019\u00ab objet de phase \u00bb en \u00ab objet d\u2019amplitude \u00bb). L\u2019\u0153il humain per\u00e7oit des diff\u00e9rences de niveaux de contraste \u2013 zones claires, zones sombres.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Zernike F Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung<\/i> (1935)
\nK\u00f6hler A Ein neues Beleuchtungsverfahren f\u00fcr mikrophotographische Zwecke<\/i> (1893)
\nK\u00f6hler A New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes<\/i> (1894)
\nK\u00f6hler A, Loos W Das Phasenkontrastverfahren und seine Anwendungen in der Mikroskopie<\/i> (1941)<\/p>\n

La microscopie \u00e0 contraste interf\u00e9rentiel (Differential Interference Contrast (DIC) microscopy, Nomarski Interference Contrast (NIC) microscopy<\/i>) corrige un d\u00e9faut de la microscopie \u00e0 contraste de phase en supprimant le halo autour de l\u2019image de l\u2019objet examin\u00e9. Cette technique permet d\u2019augmenter le contraste d\u2019objets transparents non color\u00e9s (cellules vivantes) ; l\u2019examen d\u2019objets d\u2019une certaine \u00e9paisseur, comme le noyau cellulaire, donne des images de qualit\u00e9 avec un degr\u00e9 de r\u00e9solution \u00e9lev\u00e9 (jusqu\u2019\u00e0 460 nm). En 1947, Francis Hughes Smith apporta une contribution importante \u00e0 la microscopie \u00e0 contraste interf\u00e9rentiel en introduisant l\u2019usage de prismes de Wollaston pour s\u00e9parer et recombiner les faisceaux lumineux. En effet, dans ce type de microscope, le faisceau de lumi\u00e8re non polaris\u00e9e issu de la source lumineuse est transform\u00e9 en lumi\u00e8re polaris\u00e9e \u00e0 45\u00b0 par un filtre de polarisation ; apr\u00e8s passage par un prisme de Wollaston, il en ressort deux faisceaux parall\u00e8les et de polarisations orthogonales (0\u00b0 et 90\u00b0) ; les deux faisceaux sont dirig\u00e9s vers l\u2019objet transparent par une lentille de condensation. En fonction des diff\u00e9rences d\u2019\u00e9paisseur ou d\u2019indice de r\u00e9fraction des structures de l\u2019objet, les deux faisceaux pr\u00e9sentent diff\u00e9rentes longueurs de trajet optique. La lentille objectif envoie les deux faisceaux polaris\u00e9s perpendiculairement et d\u00e9phas\u00e9s vers un second prisme de Wollaston situ\u00e9 dans le plan focal de l\u2019objectif. Techniquement, ce dernier d\u00e9tail pr\u00e9sente de grandes difficult\u00e9s de r\u00e9alisation. Elles furent solutionn\u00e9es par Georges Nomarski (Institut d\u2019optique, Paris) qui modifia la conception du prisme de Wollaston. C\u2019est pour cette raison que les premiers microscopes \u00e0 contraste interf\u00e9rentiel diff\u00e9rentiel, produits par la firme Carl Zeiss en 1965, portent le nom de microscopes Nomarski. Finalement, les faisceaux lumineux sont recombin\u00e9s en un faisceau unique polaris\u00e9 \u00e0 135\u00b0 avec conversion de phase (non observable par l\u2019\u0153il) en amplitude (observable). Les interf\u00e9rences entre les deux rayons provoquent des interf\u00e9rences constructives (lumineuses) ou destructives (sombres), ce qui rend observables des structures \u00e0 peine visibles en fond clair. La reconstruction \u00e0 l\u2019ordinateur \u00e0 partir de \u00ab sections optiques \u00bb donne des images tridimensionnelles (en \u00ab pseudo relief \u00bb) ; on peut \u00e9galement suivre le d\u00e9placement d\u2019organites \u00e0 l\u2019int\u00e9rieur des cellules.<\/p>\n

Note : J\u2019ai adopt\u00e9 comme principe de citer les articles originaux plut\u00f4t que les articles de revue. Cependant, Francis Hughes Smith et Georges Nomarski ayant tr\u00e8s peu publi\u00e9, je dois me contenter de citer le brevet de Smith et l\u2019article de revue de Loos :
\nSmith FH Interference microscope<\/i> (1948)
\nLoos W Das Phasenkontrastverfahren nach Zernike als biologische Forschungsmittel<\/i> (1941)<\/p>\n

M\u00e9decin, chimiste et physicien, William Hyde Wollaston est l\u2019inventeur du polariseur form\u00e9 de deux prismes de quartz ou de calcite qui porte son nom ; il s\u2019est \u00e9galement illustr\u00e9 par la d\u00e9couverte des \u00e9l\u00e9ments palladium et rhodium. Il a \u00e9t\u00e9 \u00e9lu membre, secr\u00e9taire puis pr\u00e9sident de la Royal Society<\/i> de Londres.nApr\u00e8s sa sortie des camps d\u2019internement nazis de la Seconde Guerre mondiale, George Nomarski (Centre National de la Recherche Scientifique, Saclay) entra \u00e0 l\u2019Universit\u00e9 Catholique de Louvain puis \u00e0 l\u2019\u00c9cole Sup\u00e9rieure d\u2019Optique de Paris.<\/p>\n

<\/a>Le microscope \u00e9lectronique en transmission<\/b><\/span><\/h4>\n

La grande r\u00e9volution qu\u2019attendaient les Cytologistes se produisit un peu plus d\u2019un si\u00e8cle apr\u00e8s la tourn\u00e9e europ\u00e9enne de Giovanni Battista Amici, en 1844 : ce fut l\u2019invention du microscope \u00e9lectronique par Ernst A.F. Ruska (prix Nobel de physique 1986), au cours des ann\u00e9es 1930 \u00e0 1934, mais qui ne fut op\u00e9rationnel dans les laboratoires que dans les ann\u00e9es 1950. Le caract\u00e8re ondulatoire de la lumi\u00e8re fut d\u00e9couvert par Christiaan Huygens \u00e0 la fin du XVIIe<\/sup> si\u00e8cle. La nature de la lumi\u00e8re et de son interaction avec la mati\u00e8re fut un sujet de pr\u00e9occupation pour les physiciens de la premi\u00e8re moiti\u00e9 du XXe<\/sup> si\u00e8cle ; dans certaines conditions, la lumi\u00e8re se comporte comme une particule (effet photo\u00e9lectrique), dans d\u2019autres, comme une onde. En 1923, Louis de Broglie (prix Nobel de physique en 1929) interpr\u00e9ta la dualit\u00e9 onde-particule en formulant l\u2019hypoth\u00e8se qu\u2019\u00e0 toute particule ayant une quantit\u00e9 de mouvement on peut associer une longueur d\u2019onde :<\/p>\n

\u03bb= h\/mv<\/span><\/p>\n

(h) \u00e9tant la constante de Planck, (m) la masse de la particule et (v) sa vitesse. Les r\u00e9sultats obtenus par de Broglie sur la m\u00e9canique quantique s\u2019ajoutant \u00e0 ceux d\u2019Albert Einstein (prix Nobel de physique 1921) et de Niels Bohr (prix Nobel de physique en 1922) sur les th\u00e9ories quantique et atomique permirent les rapides progr\u00e8s de la physique corpusculaire, de l\u2019\u00e9lectronique appliqu\u00e9e et de l\u2019optique quantique dans la premi\u00e8re moiti\u00e9 du XXe<\/sup> si\u00e8cle. D\u00e8s lors, des travaux sur la possibilit\u00e9 de d\u00e9velopper un microscope utilisant l\u2019onde associ\u00e9e aux \u00e9lectrons commenc\u00e8rent dans un certain nombre de pays.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Huygens C Trait\u00e9 de la Lumi\u00e8re (1690)
\nEinstein A \u00dcber einen die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt<\/i> (1905)
\nDe Broglie L Ondes et mouvements (1926)
\nBohr N Le postulat quantique et le dernier d\u00e9veloppement de th\u00e9orie atomique (1927)<\/p>\n

Chose surprenante, c\u2019est en France que le d\u00e9veloppement d\u2019un microscope \u00e9lectronique souleva le moins d\u2019int\u00e9r\u00eat. Louis de Broglie \u00e9tait un pur th\u00e9oricien ; ne disposant pas de laboratoire \u00e0 l’Institut Henri Poincar\u00e9 ou au Coll\u00e8ge de France, il en avait install\u00e9 un dans sa demeure. Il l\u2019agrandit en lui allouant un \u00e9tage de son habitation et y effectua des travaux sur la diffraction des rayons X. Un de ses \u00e9l\u00e8ves, Jean-Jacques Trillat, professeur de physique \u00e0 la Facult\u00e9 des Sciences de l’Universit\u00e9 de Besan\u00e7on, construisit un microscope en 1935 avec les modestes moyens dont il disposait. Aucune micrographie ne fut prise avec cet instrument. En 1936, son assistant, R. Fritz publia un article dans la Revue g\u00e9n\u00e9rale scientifique mettant l\u2019accent sur l\u2019int\u00e9r\u00eat de la microscopie \u00e9lectronique. Aucune mention n’est faite de ces travaux dans le recueil paru en 1946 : \u00ab L’optique \u00e9lectronique. R\u00e9unions d\u2019\u00e9tudes et de mises au point tenues sous la pr\u00e9sidence de Louis de Broglie \u00bb. Dans la pr\u00e9face, de Broglie essaya de justifier le fait que l\u2019invention du microscope \u00e9lectronique n\u2019ait pas eu lieu en France : \u00ab L’optique \u00e9lectronique aurait pu avoir en France son d\u00e9veloppement initial. D\u00e8s 1927-1928, je signalais \u00e0 l’un de mes premiers \u00e9l\u00e8ves l’int\u00e9r\u00eat qu’il y aurait \u00e0 d\u00e9velopper l’optique g\u00e9om\u00e9trique des \u00e9lectrons. Malheureusement, il n’a pas poursuivi son travail dans cette direction, et moi-m\u00eame, absorb\u00e9 par des recherches plus g\u00e9n\u00e9rales sur la m\u00e9canique ondulatoire, je n’ai pas approfondi ces questions. \u00bb Ce n\u2019est que dans les ann\u00e9es 1940 que le Centre national de la recherche scientifique alloua des cr\u00e9dits pour construire un microscope sous la direction de Pierre Grivet (Compagnie G\u00e9n\u00e9rale de T\u00e9l\u00e9graphie sans Fil) ; trois exemplaires furent install\u00e9s \u00e0 l\u2019Institut Pasteur, \u00e0 l\u2019Office national d\u2019\u00e9tudes et de recherches a\u00e9rospatiale et chez Michelin.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Trillat JJ Les preuves exp\u00e9rimentales de la m\u00e9canique ondulatoire. La diffraction des \u00e9lectrons et des particules mat\u00e9rielles (1934)
\nTrillat JJ La diffraction des \u00e9lectrons et ses applications (1935)<\/p>\n

Malgr\u00e9 les turbulences \u00e9conomiques, sociales et politiques que connut la r\u00e9publique de Weimar, le niveau scientifique g\u00e9n\u00e9ral en Allemagne \u00e9tait bien sup\u00e9rieur \u00e0 ce qu\u2019il \u00e9tait en France, malgr\u00e9 la pr\u00e9sence de quelques personnalit\u00e9s de premier plan comme Paul Langevin, Fr\u00e9d\u00e9ric et Ir\u00e8ne Joliot-Curie (tous deux prix Nobel de chimie en 1935) ou Louis de Broglie. Dans les ann\u00e9es 1920, Berlin \u00e9tait la Mecque de la physique ; s\u2019y c\u00f4toyaient des sommit\u00e9s telles que Max von Laue, (prix Nobel de physique 1914), Max Planck (prix Nobel de physique 1918), Walther Nernst (prix Nobel de chimie 1920), Albert Einstein (prix Nobel de physique 1921). Dans leur sillage, se constitua un groupe de jeunes et talentueux physiciens. En 1926, l\u2019un d\u2019entre eux, Hans Busch, publia dans Annalen der Physik<\/i> un article d\u00e9crivant la focalisation d\u2019un faisceau d\u2019\u00e9lectrons par un champ magn\u00e9tique. L\u2019ing\u00e9nieur Dennis Gabor (prix Nobel de physique 1971 pour la d\u00e9couverte de l\u2019holographie), qui faisait sa th\u00e8se \u00e0 la Technische Universit\u00e4t, Berlin Charlottenburg<\/i>, parvint \u00e0 la m\u00eame conclusion et construisit la premi\u00e8re lentille magn\u00e9tique. Cette d\u00e9couverte ouvrit la voie \u00e0 la conception de lentilles \u00e9lectrostatiques produisant un champ \u00e9lectrique capable de focaliser des faisceaux de particules charg\u00e9es (ions et \u00e9lectrons). Les premi\u00e8res versions du microscope \u00e9lectronique furent \u00e9quip\u00e9es de lentilles \u00e9lectrostatiques. Leur utilisation sous des tensions sup\u00e9rieures \u00e0 100 kilovolts posait des probl\u00e8mes pratiques ; ces lentilles souffrant d\u2019aberration sph\u00e9rique, leur usage fut limit\u00e9 aux canons \u00e0 \u00e9lectrons ; pour les microscopes, elles furent remplac\u00e9es par les lentilles magn\u00e9tiques qui ne focalisent que les faisceaux d\u2019\u00e9lectrons.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Busch H Berechnung der Bahn von Kathodenstrahlen im axialsymmetrischen elektromagnetischen Felde<\/i> (1926)<\/p>\n

En 1931, L\u00e9o Szilard, qui fut l\u2019assistant de Max von Laue, fit un rapprochement entre le travail de Hans Busch et la th\u00e9orie de la m\u00e9canique ondulatoire. L\u2019\u00e9quation de de Broglie appliqu\u00e9e \u00e0 un faisceau incident d\u2019\u00e9lectrons pr\u00e9dit que la longueur d\u2019onde sera d\u2019autant plus petite que la vitesse des \u00e9lectrons est plus grande. Avec des \u00e9lectrons acc\u00e9l\u00e9r\u00e9s sous un potentiel de 10 kilovolts, la longueur d\u2019onde th\u00e9orique est de l\u2019ordre de l\u2019Angstr\u00f6m (0,1 nm ou 100 picom\u00e8tres), ce qui est l\u2019ordre de grandeur des liaisons chimiques. Ernst Ruska, qui travaillait sous la direction de l\u2019ing\u00e9nieur \u00e9lectricien Max Knoll (Technische Hochschule<\/i>, Berlin), prit aussi connaissance de l\u2019article de Busch et entreprit la conception d\u2019un microscope. Il ne fut pas le seul \u00e0 tenter l\u2019aventure : une comp\u00e9tition s\u2019engagea avec l\u2019\u00e9quipe d\u2019Ernst Br\u00fcche (Allgemeine Elekticit\u00e4ts-Gesellschaft<\/i>). De 1931 \u00e0 1933, Knoll et Ruska construisirent un prototype dans lequel le faisceau d\u2019\u00e9lectrons \u00e9tait acc\u00e9l\u00e9r\u00e9 par une diff\u00e9rence de potentiel entre deux \u00e9lectrodes, puis focalis\u00e9 sur une cible par des aimants faisant office de lentilles \u00e9lectromagn\u00e9tiques ; l\u2019image d\u2019une grille m\u00e9tallique \u00e9tait recueillie sur un \u00e9cran. Le pouvoir de r\u00e9solution, de l\u2019ordre de la centaine de nm, d\u00e9passait \u00e0 peine celui d\u2019un microscope optique. Ce prototype est conserv\u00e9 au Deutsches Museum<\/i>, \u00e0 Munich. Malgr\u00e9 ces r\u00e9sultats d\u00e9cevants, une demande de brevet fut d\u00e9pos\u00e9e par Reinhold Rudenberg, directeur scientifique des usines Siemens & Halske AG<\/i> \u2013 du nom des fondateurs, en 1847, Werner von Siemens et Johan Georg Halske. En 1937, Rudenberg obtint de sa direction le financement n\u00e9cessaire \u00e0 la poursuite des travaux. Le microscope construit par Ruska et l\u2019ing\u00e9nieur \u00e9lectricien Bodo von Bories atteignait une r\u00e9solution de 10 nm ; il fut commercialis\u00e9 en 1938. Le travail de pionnier d\u2019Ernst Ruska sera r\u00e9compens\u00e9 (cinquante ans plus tard !) par l\u2019attribution du prix Nobel de physique 1986. La limite de r\u00e9solution du microscope \u00e9lectronique en transmission du Centre Ernst-Ruska, \u00e0 Julich, est de 50 picom\u00e8tres (0,05 nm). A titre de comparaison, la limite de r\u00e9solution de l\u2019\u0153il humain est de 100 \u00b5m (avec une lumi\u00e8re visible de 380 \u00e0 670 nm), et celle du microscope photonique, de l\u2019ordre de 200 nm.<\/p>\n

En 1933, Louis Marton quitta le groupe des physiciens de Berlin pour rejoindre le laboratoire d\u2019\u00c9mile Henriot et A. Picard \u00e0 l\u2019Universit\u00e9 libre de Bruxelles. Entre 1934 et 1937, il construisit un microscope \u00e9lectronique et publia le r\u00e9sultat de ses travaux dans le Bulletin de l\u2019Acad\u00e9mie Royale des Sciences de Belgique. Faute de financement de la part des autorit\u00e9s universitaires et gouvernementales, le projet fut abandonn\u00e9 et, en 1938, Marton partit pour les Etats-Unis. Il fut engag\u00e9 par la firme Radio Corporation of America<\/i> (RCA) de Princeton, o\u00f9 il participa \u00e0 la construction d\u2019un microscope \u00e9lectronique (1940). Ce prototype fut perfectionn\u00e9 par Vladimir Zworykin, pionnier de la t\u00e9l\u00e9vision, et par James Hillier, un transfuge de l\u2019Universit\u00e9 de Toronto, embauch\u00e9 par RCA. Deux ans plus t\u00f4t, en 1938, le groupe du physicien Eli Franklin Burton (auquel appartenait Hillier) avait construit \u00e0 Toronto le premier microscope \u00e9lectronique d\u2019Am\u00e9rique du Nord.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Busch H Berechnung der Bahn von Kathodenstrahlen im axialsymmetrischen elektromagnetischen Felde<\/i> (1926)
\nRuska E, Knoll M Die magnetische Sammelspule f\u00fcr schnelle Elektronenstrahlen<\/i> (1931)<\/span><\/p>\n

Note. Pour la r\u00e9daction de ce paragraphe, j\u2019ai b\u00e9n\u00e9fici\u00e9 d\u2019informations fournies par Emmanuel De Chambost et par Pierre Hillion, un \u00e9l\u00e8ve de Louis de Broglie.<\/span><\/p>\n

Aberrations<\/b><\/span><\/h4>\n

Des aberrations affectent les performances des microscopes \u00e9lectroniques (comme c\u2019est le cas pour les microscopes photoniques). Les d\u00e9fauts qui limitent la r\u00e9solution des optiques \u00e9lectroniques sont l\u2019aberration sph\u00e9rique, l\u2019astigmatisme et l\u2019aberration chromatique. D\u2019autres aberrations de moindre importance, appel\u00e9es distorsions, ont un effet perturbateur limit\u00e9. L’\u00e9lectron ayant un caract\u00e8re ondulatoire, un ph\u00e9nom\u00e8ne de diffraction affecte la lentille objectif. Une lentille parfaitement sph\u00e9rique devrait donner d’un objet ponctuel une image ponctuelle. Ce n’est pas le cas : l\u2019image d’un objet ponctuel est une tache (la tache d’Airy). Ce d\u00e9faut est corrig\u00e9 par l\u2019utilisation d\u2019\u00e9lectrons de tr\u00e8s courte longueur d’onde et par un \u00e9largissement de l\u2019angle d’ouverture de la lentille objectif. En 1933, le physicien Otto Scherzer (Allgemeine Elekticit\u00e4ts-Gesellschaft<\/em>) avait d\u00e9montr\u00e9 que les objectifs magn\u00e9tique ou \u00e9lectrostatique pr\u00e9sentent une aberration sph\u00e9rique positive. Dans les lentilles magn\u00e9tiques, il est difficile de contr\u00f4ler la forme de la r\u00e9partition spatiale de flux magn\u00e9tique. Les \u00e9lectrons passant \u00e0 distance de l\u2019axe de sym\u00e9trie de r\u00e9volution subissent une force perturbatrice qui les am\u00e8ne \u00e0 \u00eatre focalis\u00e9s plus pr\u00e8s de la lentille que ceux passant \u00e0 proximit\u00e9 de l\u2019axe. L’image d’un objet ponctuel est un disque. Ce d\u00e9faut de focalisation est minimis\u00e9 par l\u2019utilisation d\u2019un circuit \u00e9lectronique additionnel modifiant la focalisation du faisceau d\u2019\u00e9lectrons. On utilise des lentilles de tr\u00e8s faible ouverture, \u00e0 focale tr\u00e8s courte (quelques mm), \u00e0 grandissement \u00e9lev\u00e9, excit\u00e9es \u00e0 un r\u00e9gime proche de la saturation.<\/p>\n

L\u2019astigmatisme des lentilles \u00e9lectroniques est provoqu\u00e9 par les obstacles mat\u00e9riels \u00e0 la construction de lentilles \u00e0 sym\u00e9trie de r\u00e9volution parfaite (d\u00e9faut d\u2019homog\u00e9n\u00e9it\u00e9 des propri\u00e9t\u00e9s magn\u00e9tiques du m\u00e9tal des pi\u00e8ces polaires, d\u00e9fauts d’usinage, contamination des surfaces et des diaphragmes) ; cela entra\u00eene des diff\u00e9rences de distance focale selon le plan passant par l\u2019axe optique. La correction de l\u2019astigmatisme est possible par superposition d\u2019un champ \u00e0 sym\u00e9trie elliptique, \u00e0 intensit\u00e9 et direction r\u00e9glables. On sait maintenant r\u00e9aliser et introduire \u00e0 l’int\u00e9rieur de la lentille objectif des correcteurs d’astigmatisme. Le principe en est simple : cr\u00e9er au moyen de petites bobines un champ \u00e9quivalent \u00e0 une faible lentille cylindrique de convergence et de distribution azimutale r\u00e9glables de fa\u00e7on \u00e0 compenser les d\u00e9fauts de la lentille principale. A la suite des travaux de Fran\u00e7ois Bertein (1947), un \u00e9l\u00e8ve de P. Grivet, un dispositif corrigeant l\u2019astigmatisme des objectifs fut con\u00e7u et brevet\u00e9 (1948). Aux Etats-Unis, James Hillier con\u00e7ut un stigmateur m\u00e9canique \u00e0 vis qui \u00e9quipa le microscope \u00e9lectronique \u00e0 haute r\u00e9solution de RCA.<\/p>\n

L\u2019aberration chromatique est due au fait que la distance focale d\u2019une lentille \u00e9lectronique est proportionnelle \u00e0 l\u2019\u00e9nergie des \u00e9lectrons incidents. Tout \u00e9cart \u00e0 la monochromaticit\u00e9 du faisceau d’\u00e9lectrons donne d\u2019une image ponctuelle un disque. Le rayon de ce disque d\u00e9finit l\u2019aberration chromatique. Ce d\u00e9faut est corrig\u00e9 par l’incorporation d\u2019un dispositif de filtrage des \u00e9lectrons transmis. Les aberrations appel\u00e9es distorsions sont caract\u00e9ris\u00e9es par le d\u00e9placement d\u2019un point de l\u2019image par rapport \u00e0 sa position th\u00e9orique, d\u00e9placement qui est fonction de la distance \u00e0 l\u2019axe optique. On distingue les distorsions par d\u00e9placement radial (distorsion en barillet ou en croissant) et les distorsions par d\u00e9placement tangentiel, l\u2019angle de rotation de l\u2019image variant avec la distance \u00e0 l\u2019axe optique. Les autres aberrations : de coma, de courbure de champ, de distorsion, n’interviennent qu’au second ordre, ou pour les lentilles de projection. Par contre, on peut aussi classer parmi les aberrations ou d\u00e9fauts de la lentille, m\u00eame si cette derni\u00e8re est parfaite, l’erreur de mise au point, ou d\u00e9focalisation.<\/p>\n

Techniques annexes<\/b><\/span><\/h4>\n

Les d\u00e9buts en Biologie de la microscopie \u00e9lectronique furent h\u00e9sitants. Tout \u00e9tait \u00e0 inventer avec ce nouvel instrument. A Bruxelles, Marton avait envisag\u00e9 d\u2019examiner du mat\u00e9riel biologique au microscope \u00e9lectronique mais c\u2019est \u00e0 New York que la premi\u00e8re micrographie fut prise : Claude et Ernest Fullam dispos\u00e8rent une fraction subcellulaire (mitochondries) sur un film de plastique soutenu par une grille m\u00e9tallique. Apr\u00e8s dessiccation compl\u00e8te (le microscope \u00e9lectronique op\u00e8re sous un vide d\u2019environ 10-4<\/sup> torr), l\u2019\u00e9chantillon fut introduit dans le microscope RCA Model EMB de la firme Interchemical Corporation<\/i>, dirig\u00e9e par Albert Gessler. La premi\u00e8re micrographie \u00e9lectronique d\u2019une cellule eucaryote fut r\u00e9alis\u00e9e. Dans le d\u00e9partement de James Murphy (The Rockefeller Institute for Medical Research<\/i>), Keith Porter \u00e9tait parvenu \u00e0 cultiver des fibroblastes d\u2019embryons de poulet sur film de plastique. En juillet 1944, Porter et Fullam, dispos\u00e8rent sur la grille une pr\u00e9paration cellulaire fix\u00e9e aux vapeurs de t\u00e9traoxyde d\u2019osmium (introduit en microscopie par Marton). Apr\u00e8s dessiccation, ils obtinrent la premi\u00e8re micrographie d\u2019une cellule : l\u2019image de la partie centrale, trop \u00e9paisse, \u00e9tait ininterpr\u00e9table ; par contre, les parties p\u00e9riph\u00e9riques, plus minces du fait de l\u2019\u00e9talement du fibroblaste, r\u00e9v\u00e9laient l\u2019existence d\u2019une structure r\u00e9ticulaire et de corps v\u00e9siculaires (reticulum endoplasmique). Cette exp\u00e9rience montrait qu\u2019une bonne observation n\u2019\u00e9tait possible qu\u2019avec du mat\u00e9riel biologique le plus mince possible ; le pouvoir de p\u00e9n\u00e9tration des \u00e9lectrons est faible et ils sont diffract\u00e9s par tous les atomes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Marton L La microscopie \u00e9lectronique des objets biologiques (1934)
\nClaude A, Fullam EF An electron microscope study of isolated mitochondria<\/i> (1945)
\nPorter KM, Claude A, Fullam EF A Study of Tissue Culture Cells by electron microscopy: Methods and Preliminary Observations<\/i> (1946)
\nClaude A, Porter KM, Pickels EG Electron microscope study of chicken tumor cells by electron microscopy<\/i> (1947)<\/p>\n

Le recours \u00e0 la microtomie s\u2019imposa. Ceux qui pensaient qu\u2019une adaptation des instruments utilis\u00e9s en histologie r\u00e9soudrait rapidement le probl\u00e8me durent d\u00e9chanter. Il fallut plus de dix ans pour obtenir un instrument satisfaisant. La microscopie photonique s\u2019accommode de coupes de tissus dont l\u2019\u00e9paisseur est de l\u2019ordre du microm\u00e8tre ; en microscopie \u00e9lectronique, obtenir un contraste r\u00e9v\u00e9lant les structures subcellulaires n\u2019est possible qu\u2019avec des \u00e9chantillons de moins de 100 nanom\u00e8tres d\u2019\u00e9paisseur. Fritiof S. Sj\u00f6strand (Karolinska Institutet, Stockholm<\/i>) commen\u00e7a par utiliser une laborieuse technique de recoupe de pr\u00e9parations de fibres musculaires. Par la suite, il modifia le microtome de la firme Spencer Lens Co<\/i> pour en am\u00e9liorer les performances. Des instruments furent construits par H.C. O\u2019Brien et G.M. McKinley (University of Pittsburgh<\/i>), par Fullam et A. E. Gessler (Interchemical Laboratory<\/i>). C\u2019est finalement l\u2019instrument de Keith R. Porter et Joseph Blum (The Rockefeller Institute for Medical Research<\/i>) qui s\u2019imposa, avec un m\u00e9canisme d\u2019avance du couteau pr\u00e9servant la surface du bloc \u00e0 couper, et un r\u00e9servoir de liquide pour recueillir les coupes par flottaison, afin d\u2019\u00e9viter qu\u2019elles ne se recroquevillent avant d\u2019\u00eatre d\u00e9pos\u00e9es sur une grille m\u00e9tallique,. Harrison Latta et J. Francis Hartmann (Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge<\/i>) introduisirent l\u2019usage de couteaux de verre, bient\u00f4t remplac\u00e9s par des couteaux en diamant, plus chers mais beaucoup plus r\u00e9sistants. Avec des coupes de 20 \u00e0 40 nm d\u2019\u00e9paisseur, la r\u00e9solution du microscope \u00e9lectronique pouvait atteindre une dizaine de nm.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : O\u2019Brien HC, McKinley GM New Microtome and Sectioning Method for Electron Microscopy<\/i> (1943)
\nClaude A, Fullam EF The preparation of sections of guinea pig liver for electron microscopy<\/i> (1946)
\nFullam EF, Gessler AE A high speed microtome for the electron microscope<\/i> (1946)
\nGessler AE, Fullam EF Sectioning for the electron microscope accomplished by the high speed microtome (1946)
\nLatta H, Hartmann JF Use of a Glass Edge in Thin Sectioning for Electron Microscopy<\/i> (1950)
\nSj\u00f6strand F A Method for Making Ultra-Thin Tissue Sections for Electron Microscopy at High Resolution<\/i> (1951)
\nPorter KR, Blum J A study in microtomy for electron microscopy<\/i> (1953)<\/p>\n

En m\u00eame temps que le d\u00e9veloppement de la microtomie, apparut la n\u00e9cessit\u00e9 de mettre au point des techniques de fixation et d\u2019inclusion des tissus dans un milieu solide. Pour la fixation des tissus et des cellules, Keith Porter et Frances L. Kallman utilis\u00e8rent le t\u00e9traoxyde d\u2019osmium. D\u2019autres milieux furent propos\u00e9s : le m\u00e9lange permanganate de potassium, l\u2019acrol\u00e9ine (John H. Luft, Department of Anatomy, Harvard Medical School<\/i>) et la formald\u00e9hyde (F. Blum). En 1961, David Sabatini utilisa la glutarald\u00e9hyde, qui pr\u00e9sente un double avantage : (i) l\u2019activit\u00e9 des enzymes est pr\u00e9serv\u00e9e ; (ii) ce milieu a un meilleur pouvoir de p\u00e9n\u00e9tration dans les tissus que l\u2019acide osmique et permet de fixer des \u00e9chantillons volumineux. George Palade porta son choix sur le t\u00e9traoxyde d\u2019osmium ; cet oxydant puissant interagit avec les acides gras des phospholipides ; les membranes cellulaires, rendues opaques aux \u00e9lectrons, apparaissent sous forme de lignes noires sur fond clair. L\u2019acidit\u00e9 provoquant la formation d\u2019artefacts dans les tissus, Palade dilua l\u2019acide osmique dans le tampon ac\u00e9tate\/v\u00e9ronal de Michaelis (pH 7,2 \u00e0 7,6). Le \u00ab milieu de Palade \u00bb, mis au point en 1952, fut universellement adopt\u00e9. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Palade GE A study of fixation for electron microscopy<\/i> (1952)
\nPorter K, Kallman F The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy<\/i> (1953)
\nLuft JH Permanganate\u2014a new fixative for electron microscopy<\/i> (1956)
\nLuft JH The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy<\/i> (1959)
\nClaude A. Problems of fixation for electron microscopy. Results of fixation with osmium tetroxide in acid and alkaline media<\/i> (1961)<\/p>\n

Diff\u00e9rents milieux d\u2019inclusion furent essay\u00e9s dans le but d\u2019obtenir des coupes ultra-fines. Un premier progr\u00e8s fut accompli avec le milieu \u00e0 base de m\u00e9thyl ou de butyl m\u00e9thacrylate, propos\u00e9 par Newman, Borysko et Swerdlow, qui se solidifie par dessiccation au four. L\u2019usage du m\u00e9thacrylate se heurte cependant \u00e0 des probl\u00e8mes : la polym\u00e9risation n\u2019est pas uniforme et provoque une d\u00e9formation des objets, particuli\u00e8rement dans le cas de bact\u00e9ries ; il est instable sous un faisceau d\u2019\u00e9lectrons ; il peut se former des bulles autour du sp\u00e9cimen. En 1956, Audrey M Glauert (Strangeways Research Laboratory, University Chemical Laboratory, Cambridge<\/i>) apporta la solution avec l\u2019introduction des r\u00e9sines \u00e9poxy. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Newman SB, Borysko E, Swerdlow M New Sectioning Techniques for Light and Electron Microscopy<\/i> (1949)
\nGlauert AM, Rogers GE, Glauert RH A New Embedding Medium for Electron Microscopy<\/i> (1956)
\nGlauert AM, Glauert RH Araldite as an Embedding Medium for Electron Microscopy<\/i> (1958)
\nLuft JH Improvements in epoxy resin embedding methods<\/i> (1961)<\/p>\n

Le microscope \u00e9lectronique, gr\u00e2ce \u00e0 son rapport de grossissement utile de 50.000 fois, se r\u00e9v\u00e9la un incomparable outil de d\u00e9couvertes : structure fine des mitochondries et du complexe de Golgi, v\u00e9sicules microsomiales, ribosomes\u2026 Avec les nouveaux outils d\u00e9velopp\u00e9s sous l\u2019impulsion d\u2019Albert Claude : le fractionnement subcellulaire quantitatif et l\u2019examen au microscope \u00e9lectronique des cellules et de leur contenu, l\u2019\u00e9tude des relations entre structure et fonction devint un th\u00e8me de recherche prioritaire. En 1960, un groupe de biologistes, sous la houlette de Keith Porter, fond\u00e8rent l\u2019American Society for Cell Biology<\/i>. Don W. Fawcett en fut nomm\u00e9 pr\u00e9sident au cours de la r\u00e9union qui se d\u00e9roula \u00e0 Chicago en novembre 1961. A l\u2019initiative de Detlev Bronk, directeur du Rockefeller Institute<\/i>, le v\u00e9hicule d\u2019expression de la soci\u00e9t\u00e9 fut The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology<\/i>. Le premier num\u00e9ro parut en 1955 ; son titre fut chang\u00e9 en 1962, et devint : The Journal of Cell Biology<\/i>. A la demande de George Palade et de Keith Porter, une attention particuli\u00e8re fut apport\u00e9e \u00e0 la qualit\u00e9 de reproduction des micrographies.<\/p>\n

Note : Pour la r\u00e9daction de ce sous-chapitre, je me suis inspir\u00e9 en partie de l\u2019article publi\u00e9 par George E. Palade, en 1971, dans The Journal of Cell Biology : Albert Claude and the Beginnings of Biological electron microscopy.<\/i><\/p>\n

Microscope \u00e9lectronique \u00e0 balayage<\/b><\/span><\/h4>\n

D\u00e8s 1930, Max Knoll et Manfred von Ardenne, un physicien autodidacte, pressentirent les possibilit\u00e9s ouvertes par une optique quantique bas\u00e9e sur l\u2019onde de de Broglie, mais ne disposant pas de d\u00e9tecteurs ad\u00e9quats, ils ne purent mener \u00e0 terme la construction d\u2019un microscope \u00e9lectronique. En 1935, Knoll (Telefunken Company<\/i>) con\u00e7ut un instrument permettant de visualiser la surface d\u2019un objet. Il avait montr\u00e9 qu\u2019en variant le courant alimentant les bobines \u00e9lectrostatiques faisant office de lentille on fait varier la focalisation des \u00e9lectrons ; on obtient alors un faisceau d\u2019\u00e9lectrons qui balaye la surface de l\u2019\u00e9chantillon au lieu de le p\u00e9n\u00e9trer, comme en microscopie \u00e9lectronique en transmission. A une extr\u00e9mit\u00e9 de son analyseur (un pseudo microscope), l\u2019\u00e9chantillon, plac\u00e9 dans un tube de verre scell\u00e9, recevait en surface un flux d\u2019\u00e9lectrons issu d\u2019un canon, sous une tension de 500 \u00e0 4 000 Volts. Le faisceau parcourt la surface de l\u2019\u00e9chantillon sous l\u2019effet de la d\u00e9flection que lui imposent les bobines. L\u2019\u00e9chantillon impact\u00e9 \u00e9met des \u00e9lectrons qui, apr\u00e8s amplification et modulation, produisent une image. Le grandissement \u00e9tait de 10. Von Ardenne appliqua la d\u00e9couverte de Knoll au microscope \u00e9lectronique. En 1937 et 1938, dans son laboratoire priv\u00e9 de Berlin-Lichterfelde (Forschungslaboratorium f\u00fcr Elektronenphysik<\/i>), il installa des bobines \u00e0 balayage dans un microscope en transmission mais il dut interrompre ses travaux \u00e0 l\u2019arriv\u00e9e de la guerre.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Knoll M Aufladen Potentiel und Sekund\u00e4remission elektronen bestrahlter K\u00f6rper<\/i> (1935)
\nvon Ardenne M Das Elektronen-Rastermikroskop<\/i> (1938)
\nvon Ardenne M Elektronen-Ubermikroskopie<\/i> (1940)<\/p>\n

Aux \u00c9tats-Unis, les physiciens Vladimir K. Zworykin, James J. Hillier et R.L. Snyder (Radio Corporation of America Laboratories, New Jersey<\/i>) construisirent en 1942 un microscope \u00e9lectronique \u00e0 balayage pour l\u2019examen d\u2019\u00e9chantillons solides ; \u00e9quip\u00e9 de lentilles \u00e9lectrostatiques, il atteignait une r\u00e9solution de 50 nm sous un potentiel de 10.000 \u00e9lectrons-volts. Jugeant les r\u00e9sultats insuffisants, la firme mit fin au projet. Un autre microscope fut con\u00e7u, dans les ann\u00e9es 1960, par Dennis McMullen, qui faisait sa th\u00e8se (PhD) dans le laboratoire de Charles Oatley (Cambridge University<\/i>). La mise au point par deux \u00e9tudiants : Thomas E. Everhart et Richard F.M. Thornley (Cambridge University<\/i>) d\u2019un d\u00e9tecteur d\u2019\u00e9lectrons secondaires de tr\u00e8s faible \u00e9nergie \u00e9mis par la surface (ou par une fine couche) de l\u2019objet, fut une contribution importante au v\u00e9ritable essor de la microscopie \u00e9lectronique \u00e0 balayage. Le premier instrument fut commercialis\u00e9 en 1965 par la Cambridge Instrument Company<\/i>. Le microscope \u00e9lectronique \u00e0 balayage (Scanning electron microscope<\/i>) op\u00e8re sous un vide \u00e9lev\u00e9 ; l\u2019\u00e9chantillon \u00e0 examiner est balay\u00e9 de mani\u00e8re s\u00e9quentielle, ligne par ligne, par un mince faisceau d\u2019\u00e9lectrons primaires ; leur interaction avec l\u2019objet donne naissance \u00e0 l\u2019\u00e9mission de diff\u00e9rents types d\u2019\u00e9lectrons parmi lesquels des \u00e9lectrons secondaires et des \u00e9lectrons r\u00e9trodiffus\u00e9s \u00e0 partir desquels se construit une image des contours de l\u2019\u00e9chantillon, en nuances de gris, sur l’\u00e9cran de visualisation d\u2019un moniteur. On obtient des images, \u00e0 haute r\u00e9solution et \u00e0 grande profondeur de champ ; le pouvoir s\u00e9parateur des microscopes r\u00e9cents est inf\u00e9rieur \u00e0 5 nm. La microscopie \u00e9lectronique \u00e0 balayage fournit des informations sur la topographie, et m\u00eame la composition chimique des \u00e9chantillons. Le traitement des donn\u00e9es permet de reconstituer des images tridimensionnelles cellules, d\u2019organites subcellulaires, de bact\u00e9ries, virus et micro-organismes. On a \u00e9galement utilis\u00e9 la microscopie \u00e9lectronique \u00e0 balayage pour \u00e9tudier des tissus et des organes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Zworykin VA, Hillier J, Snyder RL A scanning electron microscope<\/i> (1942)
\nMcMullen D Investigations relating to the design of electron microscopes<\/i> (1952)
\nEverhart TE Contrast formation in the scanning electron microscope<\/i> (1958)
\nEverhart TE, Wells OC, Oatley CW Factors affecting contrast and resolution in the scanning electron microscope<\/i> (1959)
\nEverhart TE, Thornley RFM Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents<\/i> (1960)
\nHaddad G, Bellali S, Takakura T, Fontanini A, Ominami Y, Bou Khalil J, Raoult D Scanning Electron Microscope: A New Potential Tool to Replace Gram Staining for Microbe Identification in Blood Cultures<\/i> (2021)<\/p>\n

<\/a>Microscope \u00e0 fluorescence (en \u00e9pifluorescence)<\/b><\/span><\/h4>\n

Le ph\u00e9nom\u00e8ne de fluorescence est connu depuis le XVIIe<\/sup> si\u00e8cle et le premier microscope \u00e0 fluorescence a \u00e9t\u00e9 construit au d\u00e9but du XXe<\/sup> (1911-1913) par les physiciens Otto Heimstaedt et Heinrich Lehmann. Il observ\u00e8rent la fluorescence \u00e9mise par des bact\u00e9ries et des tissus animaux et v\u00e9g\u00e9taux. Le principe sur lequel est bas\u00e9 le microscope \u00e0 fluorescence est simple : lorsqu\u2019une mol\u00e9cule absorbe un photon de longueur d\u2019onde appropri\u00e9e, elle passe en un temps tr\u00e8s bref (de l\u2019ordre du millioni\u00e8me de nanoseconde, 10-15<\/sup> seconde) de l\u2019\u00e9tat \u00e9lectronique fondamental \u00e0 un \u00ab \u00e9tat excit\u00e9 \u00bb hautement instable ; elle retombe \u00e0 l\u2019\u00e9tat fondamental en marquant pr\u00e9alablement un arr\u00eat \u00e0 un autre \u00e9tat excit\u00e9, pendant un temps de l\u2019ordre de la nanoseconde. Selon les cas, diff\u00e9rents ph\u00e9nom\u00e8nes accompagnent le retour \u00e0 l\u2019\u00e9tat fondamental. Dans le cas de la fluorescence, il y a \u00e9mission rapide d\u2019un photon d\u2019\u00e9nergie moins \u00e9lev\u00e9e (de longueur d\u2019onde plus grande) que celle du photon absorb\u00e9. Ce d\u00e9calage, appel\u00e9 \u00ab d\u00e9placement de Stokes \u00bb, a \u00e9t\u00e9 d\u00e9crit en 1852 par le physicien George G. Stokes (University of Cambridge<\/i>). L\u2019observation d\u2019un \u00e9chantillon fluorescent est d\u2019autant plus facile que le d\u00e9placement de Stokes est plus \u00e9lev\u00e9. En disposant d\u2019un instrument appropri\u00e9 (un spectrofluorim\u00e8tre, par exemple), il est possible de distinguer la lumi\u00e8re incidente de la lumi\u00e8re fluorescente \u00e9mise. Lorsque la mol\u00e9cule est d\u00e9tectable, on la qualifie de fluorescente. Bien qu\u2019il soit impossible de pr\u00e9dire \u00e0 partir de la seule formule chimique si une mol\u00e9cule sera ou non fluorescente, on constate que les \u00ab fluorophores \u00bb ou \u00ab fluorochromes \u00bb contiennent souvent des cycles aromatiques avec doubles liaisons conjugu\u00e9es. Tr\u00e8s peu de mol\u00e9cules \u2013 et tr\u00e8s peu de mol\u00e9cules biologiques \u2013 pr\u00e9sentent une fluorescence primaire, c\u2019est-\u00e0-dire sont spontan\u00e9ment fluorescentes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Stokes GG On the change in refrangibility of light<\/i> (1852)<\/p>\n

Le succ\u00e8s de la microscopie \u00e0 fluorescence est d\u00fb en partie au co\u00fbt moins \u00e9lev\u00e9 de l\u2019appareillage par comparaison \u00e0 la microscopie \u00e9lectronique (sans avoir exactement la m\u00eame utilit\u00e9). Il suffit de disposer d\u2019un microscope optique \u00e9quip\u00e9 d\u2019un dispositif s\u00e9lectionnant les longueurs d\u2019onde des lumi\u00e8res incidente et r\u00e9\u00e9mise. La limite de r\u00e9solution des premiers instruments \u00e9tait faible : environ 200 nm. Les images manquaient de nettet\u00e9 et de r\u00e9solution : les coupes de tissus ayant une \u00e9paisseur finie, un point fluorescent est entour\u00e9 d\u2019autres points fluorescents et les images \u00e9taient brouill\u00e9es par une fluorescence diffuse. Il fallut plus d\u2019un demi-si\u00e8cle aux ing\u00e9nieurs et techniciens pour parvenir \u00e0 \u00e9liminer la fluorescence diffuse par l\u2019addition de filtres qui ne s\u00e9lectionnent que la lumi\u00e8re \u00e9mise. <\/p>\n

En 1953, Marvin Mirsky (Massachusetts Institute of Technology<\/i>) eut l\u2019id\u00e9e de coupler microscopie \u00e0 fluorescence et technique confocale. Dans le microscope confocal \u00e0 fluorescence<\/b> (Laser Confocal Microcospe<\/i>), commercialis\u00e9 \u00e0 partir de 1955, le sp\u00e9cimen est illumin\u00e9 par un rayonnement laser monochromatique ; lumi\u00e8re incidente et lumi\u00e8re d\u2019\u00e9mission sont \u00ab filtr\u00e9s \u00bb par un orifice (pinhole<\/i>) de tr\u00e8s faible diam\u00e8tre. L\u2019\u00e9limination de la lumi\u00e8re parasite diffus\u00e9e est assur\u00e9e par le choix d\u2019orifices de diff\u00e9rents diam\u00e8tres et par le balayage lat\u00e9ral de zones ponctuelles successives (Laser Scanning Confocal Microscopy<\/i>). Le faisceau laser illumine uniquement les fluorophores situ\u00e9s sur le trajet optique, d\u00e9coupant ainsi l\u2019\u00e9chantillon en fines tranches virtuelles. De plus, la lumi\u00e8re \u00e9mise par les fluorophores est capt\u00e9e par un miroir dichro\u00efque qui \u00e9limine les longueurs d\u2019onde ind\u00e9sirables. La suppression du \u00ab bruit de fond \u00bb augmente la nettet\u00e9 des images. La lumi\u00e8re \u00e9mise par le fluorophore excit\u00e9 par le rayon laser est capt\u00e9e par un tube photomultiplicateur ou une cam\u00e9ra. On obtient des images tridimensionnelles avec une bonne r\u00e9solution. On peut suivre en temps r\u00e9el les variations de concentration des ions (Ca2+<\/sup>) au sein des cellules, en employant des sondes fluorescentes qui changent de couleur ou d’intensit\u00e9 en fonction de la concentration ionique. En fonction de l\u2019\u00e9quipement d\u2019imagerie de fluorescence du microscope confocal, on a pu observer non seulement des \u00e9chantillons biologiques fix\u00e9s et marqu\u00e9s par des fluorophores, mais aussi la dynamique des compartiments membranaires ou des macromol\u00e9cules biologiques au sein des cellules.<\/p>\n

Comme je l\u2019ai dit plus haut, les constituants cellulaires ne sont pas spontan\u00e9ment fluorescents (fluorescence primaire) \u00e0 quelques exceptions pr\u00e8s : la chlorophylle, pr\u00e9sente dans les chloroplastes des cellules v\u00e9g\u00e9tales, \u00e9met une fluorescence rouge. Au d\u00e9but des ann\u00e9es 1960, Osamu Shimomura (Princeton University<\/i>) isola du syst\u00e8me luminescent des cellules de m\u00e9duse Aequoria victoria une photoprot\u00e9ine capable d\u2019\u00e9mettre de la lumi\u00e8re en pr\u00e9sence de traces de Ca2+<\/sup> ; baptis\u00e9e \u00ab aequorine \u00bb, la prot\u00e9ine verte fluorescente (Green Fluorescent Protein<\/i>) offre un moyen d\u2019\u00e9tudier le Ca2+<\/sup> intracellulaire. En 1994, Martin Chalfie (Columbia University) montra que cette prot\u00e9ine fluorescente peut \u00eatre exprim\u00e9e dans les cellules procaryotes (Escherichia Coli<\/i>) et eucaryotes (Caenorhabditis elegans<\/i>) ouvrant ainsi la voie \u00e0 une utilisation en biologie. Roger Tsien (Howard Hughes Medical Institute, University of California, San Diego<\/i>) construisit par ing\u00e9nierie g\u00e9n\u00e9tique des prot\u00e9ines modifi\u00e9es \u00e9mettant, apr\u00e8s excitation, une lumi\u00e8re jaune, bleue ou violette, ce qui \u00e9largit le spectre de longueurs d\u2019onde d\u2019\u00e9mission utilisables. Les prot\u00e9ines fluorescentes sont g\u00e9n\u00e9ralement fusionn\u00e9es par couplage \u00e0 une prot\u00e9ine cellulaire dont on veut \u00e9tablir la localisation ou suivre les d\u00e9placements au sein de la cellule. On peut aussi obtenir des souris transg\u00e9niques dont les cellules synth\u00e9tisent la prot\u00e9ine verte fluorescente. L\u2019emploi sous toutes leurs formes des prot\u00e9ines fluorescentes est \u00e0 l\u2019origine du d\u00e9veloppement de l\u2019imagerie mol\u00e9culaire (imagerie de fluorescence) ; cette discipline, \u00e0 la crois\u00e9e de la biologie mol\u00e9culaire et de la biologie cellulaire, offre une approche non-invasive : la prot\u00e9ine dont on veut observer le comportement est produite par les cellules elles-m\u00eames. Son \u00e9mergence a \u00e9t\u00e9 grandement facilit\u00e9e par des progr\u00e8s technologiques (i) les syst\u00e8mes de d\u00e9tection (capteur photographique avec dispositif \u00e0 transfert de charge : Charge-Coupled Device Camera<\/i>) ; le rayonnement \u00e9mis par l\u2019objet fluorescent est transform\u00e9 en signal \u00e9lectrique qui est \u00e0 son tour transform\u00e9 en image ; (ii) la tomographie (reconstitution tridimensionnelle d\u2019un objet analys\u00e9 tranche par tranche) ; (iii) le traitement informatique des images. C\u2019est le moyen le plus \u00e9l\u00e9gant que l\u2019on ait trouv\u00e9 pour observer in vivo le fonctionnement de la cellule. Shimomura, Tsien et Chalfie re\u00e7urent le prix Nobel de chimie en 2008.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression<\/i> (1994)
\nHeim R, Tsien RY Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer<\/i> (1996)
\nShimomura O, Johnson FH, Saiga Y Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea<\/i> (1962)
\nShimomura O, Johnson FH, Saiga Y Further data on the bioluminescent protein, aequorin<\/i> (1963)
\nShimomura O Luminescence of aequorin is triggered by the binding of two calcium ions<\/i> (1995)<\/span><\/p>\n

La microscopie \u00e0 fluorescence fait un large usage de fluorochromes issus de la synth\u00e8se chimique (fluorescence secondaire). L\u2019industrie en a produit une vaste gamme, excitables \u00e0 diff\u00e9rentes longueurs d\u2019onde. On les utilise apr\u00e8s couplage, g\u00e9n\u00e9ralement \u00e0 un anticorps dress\u00e9 contre un constituant cellulaire. Une exception : le diamidino ph\u00e9nylindole (DAPI) est directement utilisable ; il se lie \u00e0 l\u2019ADN bicat\u00e9naire, marquant ainsi le noyau cellulaire qui \u00e9met une fluorescence bleue. Le fura-2 (acide amino-polycarboxylique) fixe sp\u00e9cifiquement les ions Ca2+<\/sup> pr\u00e9sents dans certains compartiments cellulaires en \u00e9mettant une fluorescence variant du vert au jaune. L\u2019un des fluorochromes les plus anciennement utilis\u00e9s est la fluoresc\u00e9ine : stimul\u00e9e par une lumi\u00e8re incidente bleue (longueur d\u2019onde : 450-490 nanom\u00e8tres), elle \u00e9met une fluorescence verte (longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re d\u2019\u00e9mission : 520-560 nanom\u00e8tres). La rhodamine B \u00e9met une fluorescence rouge apr\u00e8s excitation par une lumi\u00e8re jaune vert. En 1982, Roger Tsien a synth\u00e9tis\u00e9 un d\u00e9riv\u00e9 de la fluoresc\u00e9ine, le BCECF et son ester BCECF-AM capable de franchir la barri\u00e8re membranaire entourant les cellules. Le BCECF est utilis\u00e9 sans couplage pour mesurer le pH intracellulaire ou la concentration en ion K+<\/sup>. Le SNARF-1, un autre r\u00e9actif employ\u00e9 pour la mesure du pH intracellulaire, r\u00e9agit \u00e0 la concentration en ions H+<\/sup>.<\/p>\n

Pour le couplage des fluorochromes, les anticorps monoclonaux ont avantageusement remplac\u00e9 les anticorps polyclonaux des d\u00e9buts. Ces derniers reconnaissent plusieurs d\u00e9terminants de l\u2019antig\u00e8ne ; les anticorps monoclonaux sont sp\u00e9cifiques d\u2019un seul d\u00e9terminant. Les anticorps plolyclonaux sont obtenus par une s\u00e9rie d\u2019injections d\u2019un antig\u00e8ne (une prot\u00e9ine) \u00e0 un lapin. Le s\u00e9rum de lapin recueilli constitue la source d\u2019anticorps. La production d\u2019un anticorps monoclonal commence de la m\u00eame fa\u00e7on par l\u2019injection d\u2019un antig\u00e8ne \u00e0 des animaux de laboratoires (le plus souvent des souris). Apr\u00e8s pr\u00e9l\u00e8vement de la rate, les cellules sont lib\u00e9r\u00e9es, tri\u00e9es et test\u00e9es ; celles qui produisent et secr\u00e8tent l\u2019anticorps (plasmocytes) sont s\u00e9lectionn\u00e9es. Les plasmocytes sont \u00ab immortalis\u00e9s \u00bb en les fusionnant avec des cellules de my\u00e9lome qui ont la capacit\u00e9 de se multiplier ind\u00e9finiment aussi longtemps que le milieu de culture est renouvel\u00e9. Cette technique, dite des hybridomes, fut mise au point \u00e0 la fin des ann\u00e9es 1970 par C\u00e9sar Milstein (Department of Biochemistry, University of Cambridge<\/em>) et un \u00e9tudiant post-doctoral, Georges J.F. K\u00f6hler. Elle permet de produire de grandes quantit\u00e9s d\u2019anticorps monoclonaux (une r\u00e9volution en immunologie). C\u00e9sar Milstein, Georges K\u00f6hler et l\u2019immunologiste Niels K. Jerne partag\u00e8rent en 1984 le prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine. En pratique, l\u2019anticorps monoclonal coupl\u00e9 \u00e0 un marqueur fluorescent n\u2019est pas utilis\u00e9 directement. Pour avoir des signaux d\u2019intensit\u00e9 suffisante et obtenir une sensibilit\u00e9 \u00e9lev\u00e9e on laisse l\u2019anticorps monoclonal r\u00e9agir avec la cible puis on ajoute un anticorps secondaire dirig\u00e9 contre l\u2019anticorps monoclonal et li\u00e9 \u00e0 un marqueur fluorescent. Dans certains cas, on utilise le couplage \u00e0 un enzyme (immunocytochimie indirecte).<\/p>\n

Microscopie \u00e0 super-r\u00e9solution<\/b><\/span><\/h3>\n

Il semblerait que pour un certain nombre de physiciens d\u00e9passer le mur de la diffraction qui limite la r\u00e9solution spatiale du microscope optique ait \u00e9t\u00e9 per\u00e7u comme un d\u00e9fi. C\u2019est pour relever ce d\u00e9fi et apr\u00e8s de longues ann\u00e9es de t\u00e2tonnements, qu\u2019ont \u00e9t\u00e9 con\u00e7us les syst\u00e8mes optiques \u00e0 super-r\u00e9solution. Un moyen de voir des objets beaucoup plus petits que la valeur d\u2019une longueur d\u2019onde de la radiation incidente est de r\u00e9duire cette longueur d\u2019onde. Le premier \u00e0 franchir la \u00ab barri\u00e8re d\u2019Abbe \u00bb fut Walter Lukosz (Institut A f\u00fcr Physik, Technische Hochschule, Braunschweig<\/i>) ; il a obtenu un modeste gain de r\u00e9solution spatiale de l\u2019ordre de deux en r\u00e9duisant la gamme de fr\u00e9quences de la lumi\u00e8re transmise \u2013 la bande passante spatiale \u2013 avec des filtres compl\u00e9mentaires (r\u00e9seaux lin\u00e9aires ou crois\u00e9s) ; le champ de l\u2019objet – la portion de la surface de l’objet que l\u2019\u0153il peut observer<\/b> \u2013 a \u00e9t\u00e9 r\u00e9duit. Les efforts d\u2019Eric A. Ash et de George Nicholls (University College, London<\/i>) pour aller plus loin dans cette voie se sont heurt\u00e9s \u00e0 la formation d\u2019une onde lumineuse \u00e9vanescente. Une image agrandie de l\u2019objet \u00e9clair\u00e9 par une lumi\u00e8re \u00e9vanescente de faible longueur d\u2019onde, \u00e9tait produite par le proc\u00e9d\u00e9 holographique de H. Nassenstein (Abteilung f\u00fcr Angewandte Physik der Farbenfabriken Bayer AG, Leverkusen<\/i>).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Lukosz W Optical systems with resolving powers exceeding the classical limit<\/i> (1966)
\nBachl A, Lukosz W Experiments on superresolution imaging of a reduced object field<\/i> (1967)
\nNassenstein H Holography with surface waves<\/i> (`Subwaves’) (1970)
\nAsh EA, Nicholls G Super-resolution aperture scanning microscope<\/i> (1972)<\/p>\n

A ce stade, un petit rappel s\u2019impose. En 1835, George B. Airy avait montr\u00e9, qu\u2019\u00e0 cause de la diffraction (d\u00e9couverte dans les ann\u00e9es 1820), l\u2019image d\u2019une mol\u00e9cule lumineuse n\u2019est pas un point mais une tache. Pour un syst\u00e8me optique, la limite de s\u00e9paration de deux objets ponctuels est d\u00e9finie par le crit\u00e8re de Rayleigh, du nom du physicien John W.S. Rayleigh (The University of Cambridge<\/i>, prix Nobel de physique 1904) :<\/p>\n

\u03b8 = 1,22 \u03bb\/D<\/span><\/p>\n

o\u00f9 \u03b8 est l’angle minimal entre deux objets ponctuels qu\u2019un instrument optique peut s\u00e9parer, \u03bb, la longueur d’onde de la lumi\u00e8re et D, le diam\u00e8tre de l’ouverture de l’instrument. Autrement dit, la r\u00e9solution d\u2019un microscope est inversement proportionnelle \u00e0 la longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re incidente (Ernst C. Abbe, 1873).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Airy GB On the Diffraction of an Object-glass with Circular Aperture<\/i> (1835)<\/p>\n

En 1984, Mike Isaacson et Aaron Lewis (Cornell University<\/i>) diminu\u00e8rent d\u2019une fraction la longueur d\u2019onde de la lumi\u00e8re incidente en l\u2019obligeant \u00e0 traverser un orifice de tr\u00e8s faible diam\u00e8tre (30 nm). Ils construisirent un microscope optique \u00e9quip\u00e9 de ce dispositif. Sans faisceau d\u2019\u00e9lectrons et sanslentilles, le microscope optique en champ proche<\/b> (Near-field scanning optical microscope<\/i>) d\u2019Isaacson et Lewis atteignait la m\u00eame r\u00e9solution qu\u2019un microscope \u00e9lectronique.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Lewis A, Isaacson M, Harootunian A, Muray A Development of a 500\u00c5 spatial resolution light microscope<\/i> (1984)<\/p>\n

Une contribution importante au d\u00e9veloppement de la microscopie \u00e0 super-r\u00e9solution a \u00e9t\u00e9 apport\u00e9e par la d\u00e9couverte des mol\u00e9cules fluorescentes photoactivables ; parmi celles-ci les plus \u00e9tudi\u00e9es sont les diff\u00e9rentes esp\u00e8ces de prot\u00e9ine verte fluorescente photo-activable (Photoactivatable Green Fluorescent Protein<\/i>). Lorsqu\u2019elles sont \u00e9clair\u00e9es par une lumi\u00e8re d\u2019une longueur d\u2019onde donn\u00e9e, ces mol\u00e9cules passent de l\u2019\u00e9tat fondamental \u00e0 un \u00e9tat activ\u00e9 fluorescent ; elles peuvent \u00eatre d\u00e9sactiv\u00e9es, ou excit\u00e9es \u00e0 un \u00e9tat diff\u00e9rent, par une lumi\u00e8re d\u2019une autre longueur d\u2019onde ; en d\u2019autres termes, on peut \u00e9teindre ou modifier leur fluorescence (mol\u00e9cules fluorescentes photo-convertibles) par un effet d\u2019interrupteur ON\/OFF, sp\u00e9cifique de chaque prot\u00e9ine ; on peut ainsi s\u00e9lectionner des mol\u00e9cules individuelles au sein d\u2019un m\u00e9lange. En 2006, Samuel T. Hess, Thanu P.K. Girirajan et Michael D. Mason (University of Maine College of Liberal Arts and Sciences, Orono<\/i>) mirent au point une technique d’imagerie en super-r\u00e9solution : la microscopie par photoactivation, localisation et fluorescence<\/b> (Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy<\/i>). La distribution spatiale pr\u00e9cise des mol\u00e9cules vertes fluorescentes photoactivables est \u00e9tablie en activant de mani\u00e8re al\u00e9atoire, \u00e0 un moment donn\u00e9, un petit nombre d\u2019entre elles avec le faisceau \u00e0 faible intensit\u00e9 d\u2019un laser \u00e0 haute fr\u00e9quence. La fluorescence est enregistr\u00e9e par un capteur CCD (Charge Coupled Device<\/i>) ; on nettoie le champ en \u00e9teignant de mani\u00e8re r\u00e9versible les fluorophores ou par photoblanchiment (photobleaching<\/i>). L\u2019image finale, \u00e0 l\u2019\u00e9chelle du nanom\u00e8tre, est construite \u00e0 l\u2019aide d\u2019algorithmes informatiques \u00e0 partir de tous les enregistrements de la distribution spatiale des biomol\u00e9cules.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Hess TS, Girirajan TPK, Mason MD Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy<\/i> (2006)<\/p>\n

Dans la microscopie \u00e0 \u00e9mission d\u00e9pl\u00e9tion stimul\u00e9e<\/b> STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy<\/i>), l\u2019objet est stimul\u00e9 par un laser d\u2019excitation ; les fluorophores situ\u00e9s en p\u00e9riph\u00e9rie du point d’excitation sont d\u00e9sactiv\u00e9s par \u00e9mission stimul\u00e9e \u00e0 l\u2019aide d\u2019un laser en couronne (donut<\/i>). La taille effective du point focal est ainsi r\u00e9duite et la r\u00e9solution spatiale, augment\u00e9e. Stefan W. Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Heidelberg<\/i>), le promoteur de la microscopie STED, a partag\u00e9 le prix Nobel de chimie 2014 avec Eric Betzig et William Moerner.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Hell SW Far-Field Optical Nanoscopy<\/i> (2007)<\/p>\n

Les techniques de microscopie de localisation de mol\u00e9cules individuelles<\/b> SMLM (Single Molecule Localization Microscopy<\/i>) sont toutes bas\u00e9es sur le m\u00eame principe : localiser des mol\u00e9cules uniques pour cr\u00e9er des images \u00e0 tr\u00e8s haute r\u00e9solution, \u00e0 l\u2019\u00e9chelle nanom\u00e9trique, g\u00e9n\u00e9r\u00e9es par traitement informatique. Les mol\u00e9cules fluorescentes sont activ\u00e9es de mani\u00e8re al\u00e9atoire, s\u00e9par\u00e9ment dans le temps ; \u00e0 un instant donn\u00e9, seul un petit nombre de mol\u00e9cules sont allum\u00e9es ; le centre de la tache de diffraction de chaque mol\u00e9cule est localis\u00e9 avec pr\u00e9cision. A partir des donn\u00e9es d\u2019une s\u00e9rie d\u2019enregistrements, on proc\u00e8de \u00e0 une reconstruction algorithmique d\u2019une image de super-r\u00e9solution. La d\u00e9nomination \u00ab microscopie de localisation de mol\u00e9cules individuelles \u00bb fait r\u00e9f\u00e9rence \u00e0 deux techniques : la microscopie PALM et la microscopie STORM. <\/p>\n

La microscopie par localisation photoactiv\u00e9e<\/b> PALM (Photoactivated Localization Microscopy<\/i>) a \u00e9t\u00e9 invent\u00e9e par le physicien Eric Betzig (Molecular and Cell Biology Department, The University of California, Berkeley<\/i>). C\u2019est une microscopie en fluorescence dite en champ large, applicable aux objets de faible \u00e9paisseur et induisant peu de blanchiment. Elle est bas\u00e9e sur le principe \u00e9nonc\u00e9 ci-dessus : stimuler bri\u00e8vement la fluorescence de biomol\u00e9cules individuelles ; celles-ci \u00e9mettant de la lumi\u00e8re une par une, il est possible de s\u00e9parer les photons venant de chaque \u00e9metteur. La r\u00e9solution obtenue est de l\u2019ordre de 20 nm. Eric Betzig a re\u00e7u le prix Nobel de chimie 2014.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Lewis A, Isaacson M, Harootunian A, Muray A Development of a 500\u00c5 spatial resolution light microscope<\/i> (1984)
\nBetzig E, Harootunian A, Lewis A, Isaacson M Near-field diffraction by a slit: implications for superresolution microscopy<\/i> (1986)
\nBetzig E, Lewis A, Harootunian A, Isaacson M, Kratschmer E Near-field scanning optical microscopy: development and biophysical applications<\/i> (1986)
\nBetzig E, Trautman JK Near-Field Optics : Microscopy, Spectroscopy, and Surface Modification Beyond the Diffraction Limit<\/i> (1992)<\/p>\n

En 2006, Michael J. Rust, Mark Bates et Xiaowei Zhuang (Xiamen University Malaysia Campus<\/i>) ont invent\u00e9 la microscopie de reconstruction stochastique<\/b> STORM (Stochastic Optical reconstruction Microscopy<\/i>). L\u2019image est reconstruite en combinant les informations de localisation de haute pr\u00e9cision de fluorophores individuels, en plusieurs couleurs et en trois dimensions (en utilisant une optique 3D-STORM appropri\u00e9e). Un petit nombre de fluorophores individuels sont activ\u00e9s ou d\u00e9sactiv\u00e9s de mani\u00e8re al\u00e9atoire (stochastique), \u00e0 des longueurs d\u2019onde donn\u00e9es ; la s\u00e9paration temporelle de ces mol\u00e9cules est obtenue en utilisant une lumi\u00e8re de tr\u00e8s faible intensit\u00e9. Le clignotement ainsi produit est enregistr\u00e9 de mol\u00e9cule \u00e0 mol\u00e9cule. Lorsque tous les points ont \u00e9t\u00e9 activ\u00e9s, la combinaison informatique des coordonn\u00e9es mol\u00e9culaires en trois dimensions permet d’obtenir des images 3D de super-r\u00e9solution.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Rust, MJ, Bates M, Zhuang X Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) <\/i> (2006)
\nB Huang B, W Wang W, M Bates M, X Zhuang X Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy<\/i> (2008)<\/p>\n

Le pionnier de la microscopie \u00e0 illumination structur\u00e9e<\/b> SIM (Structured Illumination Microscopy<\/i>) est Mats G.L. Gustafsson (Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco<\/i>). Dans cette technique, au lieu d\u2019\u00eatre \u00e9clair\u00e9 par une lumi\u00e8re uniforme, l’\u00e9chantillon est illumin\u00e9 s\u00e9quentiellement par un r\u00e9seau de franges ou de grilles lumineuses, orient\u00e9es et d\u00e9phas\u00e9es de diff\u00e9rentes mani\u00e8res. L\u2019interaction entre le motif lumineux structur\u00e9 et les structures fines de l’\u00e9chantillon g\u00e9n\u00e8re des franges de Moir\u00e9 de basse fr\u00e9quence qui contiennent des informations de haute fr\u00e9quence spatiale. Plusieurs images, avec des motifs d\u00e9cal\u00e9s et tourn\u00e9s, sont captur\u00e9es et trait\u00e9es math\u00e9matiquement pour reconstruire une image de super-r\u00e9solution. La microscopie \u00e0 illumination structur\u00e9e offre comme avantages une am\u00e9lioration de la r\u00e9solution (100 nm) deux fois sup\u00e9rieure \u00e0 la limite de diffraction conventionnelle et la possibilit\u00e9 d\u2019obtenir des images dynamiques en couleurs et en trois dimensions. La microscopie SIM, op\u00e9rant avec un \u00e9clairement relativement faible, les puissances laser utilis\u00e9es sont notablement moins \u00e9lev\u00e9es que dans les microscopies PALM, STORM ou STED ; il en r\u00e9sulte une r\u00e9duction de la phototoxicit\u00e9 permettant l’observation prolong\u00e9e, sur cellules vivantes, de processus biologiques dynamiques comme le transport v\u00e9siculaire du reticulum endopasmique \u00e0 la membrane plasmique. On utilise les m\u00eames fluorophores, colorants fluorescents ou prot\u00e9ines fluorescentes qu\u2019en microscopie \u00e0 fluorescence conventionnelle. En employant simultan\u00e9ment plusieurs marqueurs color\u00e9s, on peut obtenir une imagerie 4D (incluant le temps) en couleur des diff\u00e9rents organites subcellulaires, leurs interactions et m\u00eame leur composition (Matthew B. Stone et coll., 2017). Enfin, la microscopie SIM est une technique \u00e0 champ large (utilisant toute la surface de la cam\u00e9ra) dont la mise en \u0153uvre est plus rapide que les m\u00e9thodes microscopiques point par point.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Gustafsson MGL, Hristova Y, Moerner WE Fluorescence microscopy with superresolution lateral tomography<\/i> (1999)
\nGustafsson MGL Surpassing the lateral resolution limit by wide-field fluorescence microscopy using structured illumination <\/i> (2000)
\nStone MB, Shelby SA, Veath SL Super-Resolution Microscopy: Shedding Light on the Cellular Plasma Membrane<\/i> (2017)<\/p>\n

Dans la microscopie PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography<\/i>), la liaison des fluorophores aux organites subcellulaires ou aux structures biologiques que l\u2019on veut \u00e9tudier n\u2019est pas permanente ; les fluorophores sont li\u00e9s de mani\u00e8re al\u00e9atoire (stochastique) et r\u00e9versible, de sorte qu\u2019\u00e0 un instant donn\u00e9, seule une proportion limit\u00e9e des sondes fluorescentes est li\u00e9e \u00e0 la cible ; cette association – dissociation transitoire des fluorophores est \u00e0 la base de la microscopie PAINT. Leur localisation individuelle est rendue possible par la commutation ON\/OFF et OFF\/ON dans le temps, de leur fluorescence. La localisation pr\u00e9cise du centre de gravit\u00e9 de la t\u00e2che de diffusion est confi\u00e9e \u00e0 des algorithmes de traitement d’image. L’image finale de super-r\u00e9solution est construite \u00e0 partir des donn\u00e9es de milliers de positions des sondes fluorescentes. Dans sa version DNA-PAINT, la liaison r\u00e9versible aux structures subcellulaires est assur\u00e9e par de courts brins d’ADN compl\u00e9mentaires : un brin d’ancrage (docking strand<\/i>) fix\u00e9 par un anticorps \u00e0 la structure, et un brin imageur (imager strand<\/i>) portant le fluorophore ; la liaison entre les brin compl\u00e9mentaires d’ancrage et imageur est temporaire ; sa dur\u00e9e d\u00e9pend de la s\u00e9quence des brin d’ADN ou de leur longueur. En ajustant ces param\u00e8tres, on peut contr\u00f4ler la cin\u00e9tique du clignotement des points fluorescents. <\/p>\n

La microscopie Paint pr\u00e9sente un certain nombre d\u2019avantages par rapport aux microscopies STORM et PALM, auxquelles elle s\u2019apparente (PAINT fait aussi partie des m\u00e9thodes de microscopie de localisation de mol\u00e9cules individuelles). La r\u00e9solution (jusqu\u2019\u00e0 10 nm) est meilleure que celles obtenues avecSTORM et PALM. Le photoblanchiment du fluorophore est d\u2019autant plus facile que le brin imageur change constamment. En rempla\u00e7ant la solution de brins imageurs (sans changer leur s\u00e9quence), on peut cibler une nouvelle structure ou une autre biomol\u00e9cule ; le multiplexage, qui est compliqu\u00e9 avec PALM et tr\u00e8s compliqu\u00e9 avec STORM, ne l\u2019est pas avec DNA-PAINT (images multi-couleurs).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Nieves DJ, Gaus K, Baker MAB DNA-Based Super-Resolution Microscopy: DNA-PAINT<\/i> (2018)<\/p>\n

Il n\u2019est pas exag\u00e9r\u00e9 de dire que, dans le domaine de la Biologie cellulaire, l\u2019introduction de la microscopie \u00e0 super-r\u00e9solution a \u00e9t\u00e9 \u00e0 l\u2019origine d\u2019une r\u00e9volution en donnant acc\u00e8s \u00e0 l’observation \u00e0 l\u2019\u00e9chelle nanom\u00e9trique de structures subcellulaires complexes. Je vais prendre comme premier exemple l’une des structures mol\u00e9culaires la plus volumineuse et la plus sophistiqu\u00e9e de la cellule eucaryote : le complexe du pore nucl\u00e9aire. Ces orifices, qui traversent la double membrane de l\u2019enveloppe nucl\u00e9aire, constituent les points de passage du nucl\u00e9opasme au cytoplasme (pour les ARNm, ARNr) et du cytoplasme au nucl\u00e9opasme (pour les histones, polym\u00e9rases). Pour qu\u2019une macromol\u00e9cules puisse transiter par le pore nucl\u00e9aire, elle doit porter un signal de localisation sp\u00e9cifique (Nuclear Localization Signal ou Nuclear Exportation Signal<\/i>). C\u2019est en ce sens que l\u2019on peut parler de sophistication : le canal doit \u00eatre \u00e0 la fois ouvert au transport de masse et extr\u00eamement s\u00e9lectif. Sur le plan structurel, le pore nucl\u00e9aire est un cylindre constitu\u00e9 de trois anneaux concentriques, d\u2019un panier nucl\u00e9aire et de filaments cytosoliques, le tout constitu\u00e9 par l\u2019assemblage de plusieurs centaines de prot\u00e9ines (nucl\u00e9oporines), pour un poids mol\u00e9culaire d\u2019environ 125.000 kDa. Je donne ci-dessous quelques r\u00e9f\u00e9rences d\u2019articles portant sur l\u2019\u00e9tude du pore nucl\u00e9aire.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Szymborska A, de Marco A, Daigle N, Cordes VC, Briggs JAG, Ellenberg J Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging<\/i> (2013)
\nThevathasan JV, Kahnwald M, Cieslinski K, Hoess P, Peneti SK, Reitberger M Heid D, Kasuba KC, Hoerner SJ, Li Y, Wu YL, Mund M, Matti U, Pereira PM, Henriques R, Nijmeijer B, Kueblbeck M, Sabinina VJ, Ellenberg J, Ries J Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy<\/i> (2019)
\nSabinina VJ, Hossain MJ, H\u00e9rich\u00e9 JK, Hoess P, Nijmeijer B, Mosalaganti S, Kueblbeck M, Callegari A, Szymborska A, Beck M, Ries J, Ellenberg J Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex<\/i> (2021)
\nVial A, Costa L, Dosset P, Rosso P, Bouti\u00e8res G, Faklaris O, Haschke H, Milhiet PE, Doucet CM Structure and mechanics of the human Nuclear Pore Complex basket using correlative AFM-Fluorescence Superresolution Microscopy<\/i> (2023)
\nYe X, Guan M, Guo Y, Liu X, Wang K, Chen T, Zhao S, Chen L Live-cell super-resolution imaging unconventional dynamics and assemblies of nuclear pore complexes<\/i> (2023)<\/p>\n

Comme second exemple, je prendrai les invaginations de la membrane mitochondriale interne connues sous le nom de cr\u00eates mitochondriales. L\u2019existence des cristae augmente notablement la surface de cette membrane. Loin d\u2019\u00eatre des structures statiques, elles subissent un remodelage constant en fonction de l\u2019activit\u00e9 des complexes multim\u00e9riques de la cha\u00eene respiratoire (complexes I \u00e0 IV) et de l’ATP synthase (complexe V). On avait, par diverses approches, d\u00e9termin\u00e9 l\u2019ordre dans lequel sont dispos\u00e9s ces complexes sur la face de la membrane mitochondriale interne en contact avec la matrice ; la microscopie \u00e0 super-r\u00e9solution a permis l\u2019observation directe de leur organisation spatiale \u00e0 l\u2019\u00e9chelle nanom\u00e9trique. On a aussi pu d\u00e9terminer que la courbure des cr\u00eates mitochondriales leur est impos\u00e9e par les alignements r\u00e9guliers des dim\u00e8res d’ATP synthase. Enfin, on a pu montrer que les cr\u00eates mitochondriales sont des structures dynamiques dont l’organisation tridimensionnelle est li\u00e9e \u00e0 leur fonction dans la cellule normale ou pathologique.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW Mitochondrial cristae revealed with focused light<\/i> (2009)
\nDlaskov\u00e1 A, Sm\u00e9kal V, K\u0159en V, Hoz\u00e1k P 3D super-resolution microscopy reflects mitochondrial cristae alternations and mtDNA nucleoid size and distribution<\/i> (2018)
\nPalmer CS, Lou J, Kouskousis B, Pandzic E, Anderson AJ, Kang Y, Hinde E, Stojanovski D Super-resolution microscopy reveals the arrangement of inner membrane protein complexes in mammalian mitochondria<\/i> (2021)
\nSant S, Yang H, Fogo Taguchi K, Elias BC, Krystofiak E, Qian AB, Brooks CR Quantitative Super-Resolution Microscopy Reveals Promoting Mitochondrial Interconnectivity Protects against AKI<\/i> (2021)
\nLeisten ED, Woods AC, Wong YC Super resolution microscopy: Insights into mitochondria\u2013lysosome crosstalk in health and disease<\/i> (2023)
\nRen W, Ge X, Li M, Sun J, Li S, Shan C, Gao B, Xi P Visualization of cristae and mtDNA dynamics and interactions with super-resolution microscopy(2023)<\/p>\n

Articles de revue : Jakobs S, Wurm CA Super-resolution microscopy of mitochondria<\/i> (2014)
\nTeixeira P, Galland R, Chevrollier A Super-resolution microscopies, technological breakthrough to decipher mitochondrial structure and dynamic<\/i> (2024)<\/p>\n

Comme domaines d\u2019\u00e9tude o\u00f9 l\u2019emploi de la microscopie \u00e0 super r\u00e9solution a permis de substantiels progr\u00e8s des connaissances, j\u2019aurai encore pu citer les microfilaments d\u2019actine et les microtubules du cytosquelette, les mouvements intracellulaires des v\u00e9sicules de transport (les microscopies PALM, STORM, STED sont compatibles avec l\u2019\u00e9tude de cellules vivantes), les virus ou les terminaisons nerveuses (synapses).<\/p>\n

\n

<\/a><\/b>Ultracentrifugeuse<\/b><\/span><\/h2>\n

<\/b>Isoler les organites de la cellule<\/b><\/span><\/h4>\n

\u00ab\u2026 the use of the microscope, alone or in conjunction with ingenious techniques of fixation, staining, or microdissection, has repeatedly failed in answering two of the major queries of modern cytology ; namely, what is the chemical nature of the diverse protoplasmic structures and what is the intracellular topography of biochemical function. \u00bb<\/i><\/p>\n

Albert Claude<\/i><\/p>\n

La citation en exergue r\u00e9sume parfaitement le probl\u00e8me auquel furent confront\u00e9s les biologistes au milieu du XXe<\/sup> si\u00e8cle. Les microscopistes avaient d\u00e9couvert un certain nombre d\u2019organites (noyau, mitochondries, complexe de Golgi) mais avant leur s\u00e9paration du contexte cellulaire et l\u2019analyse de leur composition biochimique, leur fonction dans la cellule resta myst\u00e9rieuse. La mise \u00e0 la disposition des scientifiques d\u2019un nouvel instrument allait ouvrir un nouveau champ d\u2019exploration de la cellule. Des particules soumises \u00e0 une force se d\u00e9placent dans la direction de cette force \u00e0 une vitesse qui, en premi\u00e8re approximation, est proportionnelle \u00e0 leur taille (\u00e0 leur volume) : les grosses particules se d\u00e9placent plus vite que les petites. C\u2019est sur ce principe qu\u2019est bas\u00e9e la s\u00e9paration des organites cellulaires ; il suffit de leur appliquer une force centrifuge dans un espace restreint. Les premi\u00e8res centrifugeuses \u00e9taient actionn\u00e9es \u00e0 la main. Une centrifugeuse de ce type fut utilis\u00e9e par Friedrich Miescher en 1869 pour isoler les noyaux. Des centrifugeuses dites \u00ab pr\u00e9paratives \u00bb, anim\u00e9es par des moteurs et non plus \u00e0 la main, furent en usage \u00e0 la fin des ann\u00e9es 1920.<\/p>\n

L\u2019apparition de centrifugeuses tournant \u00e0 haute vitesse, les ultracentrifugeuses, date des ann\u00e9es 1930. Le physicien Emile J.C. Henriot (Universit\u00e9 libre de Bruxelles) et le chimiste Theodor H.E. Svedberg (Uppsala Universitet<\/i>, prix Nobel de chimie 1926), ind\u00e9pendamment l\u2019un de l\u2019autre, construisirent des ultracentrifugeuses dont la partie mobile (rotor) tournait \u00e0 tr\u00e8s grande vitesse. En 1925, le rotor horizontal de la centrifugeuse d\u2019Emile Henriot et Eug\u00e8ne Huguenard (Laboratoire d\u2019aviation de l\u2019Ecole des hautes \u00e9tudes, Bruxelles), m\u00fb par un jet d\u2019air comprim\u00e9, pouvait tourner \u00e0 200.000 tours par minute et d\u00e9velopper une force centrifuge de 400.000 g. Les champs centrifuges ainsi g\u00e9n\u00e9r\u00e9s \u00e9taient suffisamment \u00e9lev\u00e9s pour d\u00e9placer des particules de la taille des prot\u00e9ines et des acides nucl\u00e9iques. La firme Bardet de Paris construisit plusieurs exemplaires de la centrifugeuse d\u2019Henriot-Huguenard, avec le soutien financier du Fonds National de la Recherche Scientifique belge.<\/p>\n

Svedberg apporta une importante contribution dans le domaine des ultracentrifugeuses en abordant un faux probl\u00e8me. A la fin du XIXe<\/sup> si\u00e8cle et au d\u00e9but du XXe<\/sup>, circulait, surtout parmi les chimistes, la \u00ab th\u00e9orie des collo\u00efdes \u00bb, encore appel\u00e9e \u00ab th\u00e9orie des agr\u00e9gats \u00bb ou \u00ab th\u00e9orie collo\u00efdale du vivant \u00bb. Selon cette th\u00e9orie, les substances se divisaient en \u00ab cristallo\u00efdes \u00bb et \u00ab collo\u00efdes \u00bb. Ces derniers \u00e9taient de masse \u00e9lev\u00e9e et non-dialysables car compos\u00e9s de \u00ab micelles \u00bb dont la coh\u00e9sion \u00e9tait assur\u00e9e par des liaisons diff\u00e9rentes des liaisons covalentes, mais dont on ne connaissait pas la nature. L\u2019\u00e9tat collo\u00efdal \u00e9tait consid\u00e9r\u00e9 comme une caract\u00e9ristique de la mati\u00e8re vivante, en particulier du protoplasme. Toujours selon cette th\u00e9orie, la masse d\u2019une mol\u00e9cule ne pouvait pas d\u00e9passer une valeur d\u2019environ 5.000. La formation d\u2019entit\u00e9s de plus grande taille r\u00e9sultait de l\u2019association d\u2019unit\u00e9s de taille \u00e9gale ou inf\u00e9rieure \u00e0 5.000. Des ouvrages exposant ces conceptions furent publi\u00e9s, par Wladyslaw Kopaczewski et par Jacques E. Duclaux (l’Institut Pasteur, Paris).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Svedberg T Studien zur Lehre von den kolloiden L\u00f6sungen<\/i> (1908)
\nSvedberg T Die Methoden zur Herstellung kolloider L\u00f6sungen anorganischer Stoffe<\/i> (1909)
\nSvedberg T Colloid Chemistry<\/i> (1914)
\nKopaczewski W Th\u00e9orie et pratique des collo\u00efdes en biologie et en m\u00e9decine (1918)
\nDuclaux JE Les Collo\u00efdes (1922)
\nKopaczewski W Trait\u00e9 de biocollo\u00efdologie (1930)<\/span><\/p>\n

Pour soumettre la th\u00e9orie collo\u00efdale du vivant \u00e0 l\u2019\u00e9preuve exp\u00e9rimentale, Svedberg centrifugea \u00e0 tr\u00e8s haute vitesse une solution contenant des prot\u00e9ines dans une cellule en quartz sertie dans le rotor de son ultracentrifugeuse. La cellule \u00e9tait travers\u00e9e par un rayon lumineux ce qui permettait de suivre en continu le d\u00e9placement des particules dans le champ centrifuge (les acides amin\u00e9s des prot\u00e9ines absorbent le rayonnement ultraviolet). La migration des prot\u00e9ines \u00e9tait enregistr\u00e9e. Pour interpr\u00e9ter les r\u00e9sultats, Svedberg utilisa une \u00e9quation permettant de calculer la masse d\u2019une particule \u00e0 partir de sa vitesse de migration (il avait pr\u00e9alablement effectu\u00e9 une \u00e9tude th\u00e9orique du d\u00e9placement d\u2019une particule dans un champ centrifuge). Svedberg re\u00e7ut le prix Nobel de chimie 1926 ; son nom a \u00e9t\u00e9 donn\u00e9 \u00e0 une unit\u00e9 de temps : le Svedberg (S = 10-13<\/sup>sec), utilis\u00e9 pour exprimer le coefficient de s\u00e9dimentation des macromol\u00e9cules (ARN 5S) et des composants subcellulaires (ribosome 30S).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Svedberg T Die Existenz der Molek\u00fcle<\/i> (1912)
\nSvedberg T, Pedersen K The Ultracentrifuge<\/i> (1940)<\/span><\/p>\n

Contrairement \u00e0 ce que pr\u00e9disait la th\u00e9orie des collo\u00efdes la masse mol\u00e9culaire des prot\u00e9ines pouvait d\u00e9passer 5000. Le concept de \u00ab cristallo\u00efde \u00bb fut aussi durement \u00e9branl\u00e9 que celui de collo\u00efde lorsque James B. Sumner (prix Nobel de chimie en 1946) cristallisa l\u2019ur\u00e9ase, en 1926. De 1930 \u00e0 1935, ce fut le tour des enzymes prot\u00e9olytiques, parmi lesquels la pepsine. C\u2019\u00e9tait le chant du cygne de la Th\u00e9orie collo\u00efdale du Vivant au profit de la notion de \u00ab macromol\u00e9cule \u00bb, selon le terme introduit en 1922 par le chimiste Hermann Staudinger (\u00c9cole polytechnique f\u00e9d\u00e9rale, Zurich).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Sumner JB The Isolation and Crystallization of the Enzyme Urease: Preliminary Paper<\/i> (1926)
\nNorthrop JH Crystalline Pepsin<\/i> (1929)
\nStaudinger H Uber Polymerisation<\/i> (1920)<\/span><\/p>\n

Dans les ann\u00e9es 1930, le physicien Jesse W. Beams (University of Virginia<\/i>) construisit une ultracentrifugeuse magn\u00e9tique atteignant des vitesses de rotation sup\u00e9rieures \u00e0 l\u2019ultracentrifugeuse de Svedberg. Johannes H. Bauer et Edward G. Pickels, un \u00e9l\u00e8ve de Beams, construisirent une ultracentrifugeuse \u00ab analytique \u00bb mue par la pression d\u2019un jet d\u2019air et op\u00e9rant sous vide, destin\u00e9e \u00e0 la d\u00e9termination des coefficient de s\u00e9dimentation des prot\u00e9ines. Le rotor en aluminium, de petite taille et de forme ovale, \u00e9tait dot\u00e9 d\u2019une cellule transparente. La vitesse de rotation atteignait 60.000 rpm, correspondant \u00e0 une force centrifuge de 260.000 g. Les ultracentrifugeuses analytiques ne peuvent traiter que de faibles volumes ; la n\u00e9cessit\u00e9 de construires des centrifugeuses \u00ab pr\u00e9paratives \u00bb se fit sentir sous la pression des virologistes, d\u00e9sireux d\u2019obtenir des quantit\u00e9s suffisantes de virus (c\u2019\u00e9tait l\u2019\u00e9poque de la pr\u00e9paration du vaccin contre la polyomy\u00e9lite). Beams (University of Virginia<\/i>) et Pickels con\u00e7urent une telle centrifugeuse en reprenant le concept du rotor horizontal d\u2019Henriot, \u00e9quip\u00e9 de tubes de grand volume ; ils le fix\u00e8rent sur un axe vertical dans une enceinte sous vide pour \u00e9viter l\u2019\u00e9chauffement du rotor. En 1943, Pickels commen\u00e7a la construction d\u2019une centrifugeuse pr\u00e9parative dans l\u2019atelier du Rockefeller Institute for Medical Research<\/i>, avec le soutien financier de la Rockefeller Foundation<\/i>. L\u2019enceinte contenant le rotor \u00e9tait r\u00e9frig\u00e9r\u00e9e (le mat\u00e9riel biologique s\u2019alt\u00e8re rapidement \u00e0 temp\u00e9rature ordinaire) et maintenue sous vide. Pour la commercialiser, Pickels cr\u00e9a en 1949 la firme Spinco<\/i> (SPecialized INstruments COrporation<\/i>). La mise sur le march\u00e9 de la centrifugeuse Spinco ne suscita qu\u2019un enthousiasme limit\u00e9. L\u2019entreprise fr\u00f4la la faillite et fut rachet\u00e9e en 1954 par Beckman Instruments<\/i>.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Beams JW, Haynes FB The Separation of Isotopes by Centrifuging<\/i> (1936)
\nBeams JW Production and Use of High Centrifugal Fields<\/i> (1954)
\nBauer JH, Pickels EG An Improved Air-Driven Type of Ultracentrifuge for Molecular Sedimentation<\/i> (1937)<\/span><\/p>\n

Il fallut des ann\u00e9es aux biologistes pour prendre conscience des possibilit\u00e9s offertes par l\u2019ultracentrifugation pr\u00e9parative. Le d\u00e9clic se produisit apr\u00e8s la publication, en 1946, de l\u2019article d\u2019Albert Claude dans lequel il jetait les bases du fractionnement subcellulaire quantitatif<\/b>. La m\u00e9thode fut am\u00e9lior\u00e9e par ses \u00e9l\u00e8ves du Rockefeller Institute for Medical Research<\/em> : Georges Hogeboom, Walter Schneider et George Palade. La m\u00e9thode peut \u00eatre r\u00e9sum\u00e9e bri\u00e8vement ainsi : un homog\u00e9nat de tissus en suspension dans une solution de saccharose isotonique est soumis \u00e0 une s\u00e9rie de (3 ou 4) centrifugations diff\u00e9rentielles \u00e0 vitesse de rotation du rotor chaque fois plus \u00e9lev\u00e9e. Les plus gros organites, les noyaux, s\u00e9dimentent \u00e0 basse vitesse ; les plus petits organites, les microsomes, s\u00e9dimentent lors de la derni\u00e8re centrifugation \u00e0 haute vitesse. Dans les ann\u00e9es 1930, se d\u00e9veloppa une technique de s\u00e9paration des organites bas\u00e9e non plus sur leur volume, mais sur leur densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre dans un milieu de composition d\u00e9termin\u00e9e. Les premi\u00e8res exp\u00e9riences port\u00e8rent sur la s\u00e9paration de mitochondries dans des solutions de solvants organiques. Par la suite, l\u2019on utilisa des solut\u00e9s comme le saccharose pour les organites subcellulaires ou le chlorure de c\u00e9sium pour les ribonucl\u00e9oprot\u00e9ines.<\/p>\n

La commercialisation de rotors \u00e0 godets basculants en 1953 favorisa la g\u00e9n\u00e9ralisation de l\u2019usage de la centrifugation en gradient de densit\u00e9. La construction de gradients lin\u00e9aires de densit\u00e9, une condition sine qua non<\/em> du caract\u00e8re analytique de la m\u00e9thode, n\u00e9cessita la construction de machines appropri\u00e9es. Henri Beaufay et Jacques Berthet (Laboratoire de chimie physiologique, Universit\u00e9 catholique de Louvain) construisirent une machine \u00e0 cames d\u00e9livrant un gradient de densit\u00e9 lin\u00e9aire en fonction du volume et un sectionneur de tubes permettant le recueil des fractions. Dans les laboratoires ne poss\u00e9dant pas de machine \u00e0 gradient (ou h\u00e9sitant \u00e0 les utiliser), on pratiqua la superposition de couches de densit\u00e9s d\u00e9croissantes. Apr\u00e8s diffusion du solut\u00e9 pendant un temps plus ou moins long, un pseudo-gradient \u00ab en marches d\u2019escalier \u00bb s\u2019\u00e9tablit. Ce proc\u00e9d\u00e9 est souvent g\u00e9n\u00e9rateur d\u2019artefacts de s\u00e9paration (voir Chapitre Small Granules<\/em>).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Kopaczewski W Th\u00e9orie et pratique des collo\u00efdes en biologie et en m\u00e9decine (1923)
\nClaude A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation (1946)<\/span><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Voir les cellules et leur contenu Le microscope optique La cytologie est la branche de la biologie consacr\u00e9e \u00e0 l\u2019\u00e9tude de la structure et des fonctions des cellules ; elle proc\u00e8de par l\u2019examen microscopique de coupes de tissus fix\u00e9es et color\u00e9es. L\u2019\u0153il humain est un organe que l\u2019on peut assimiler \u00e0 un instrument d\u2019optique. Son … Continue reading Chapitre 1<\/span> →<\/span><\/a><\/p>\n","protected":false},"author":3,"featured_media":0,"parent":0,"menu_order":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_monsterinsights_skip_tracking":false,"footnotes":""},"class_list":["post-253","page","type-page","status-publish","hentry"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/253","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/users\/3"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=253"}],"version-history":[{"count":14,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/253\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":16993,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/253\/revisions\/16993"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=253"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}