{"id":3413,"date":"2014-02-20T16:17:21","date_gmt":"2014-02-20T15:17:21","guid":{"rendered":"http:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/?page_id=3413"},"modified":"2026-06-03T10:10:39","modified_gmt":"2026-06-03T08:10:39","slug":"chapitre-6","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/chapitre-6\/","title":{"rendered":"Chapitre 6"},"content":{"rendered":"

<\/a>\u00ab Small Granules \u00bb<\/i><\/b><\/span><\/h2>\n

\u00ab In biology, as in mechanics, one of the best ways to figure out how something works is to break it. \u00bb <\/i><\/p>\n

Gretchen Vogel<\/i><\/p>\n

La r\u00e9vocation de l\u2019Edit de Nantes par Louis XIV, en 1685, provoqua un exode massif des Huguenots fran\u00e7ais, dont certains choisirent de s\u2019\u00e9tablir dans les colonies anglaises d\u2019Am\u00e9rique du nord ; parmi eux se trouvaient les anc\u00eatres maternels de Francis Peyton Rous. A la fin de ses \u00e9tudes de m\u00e9decine \u00e0 la Johns Hopkins University,<\/i> le jeune Peyton s\u2019orienta vers la recherche et sollicita l\u2019octroi d\u2019une bourse du Rockefeller Institute for Medical Research.<\/i> Son directeur, Simon Flexner, avait lu avec int\u00e9r\u00eat un article de Rous sur les lymphocytes ; il l\u2019invita \u00e0 rejoindre la prestigieuse institution et \u00e0 prendre la direction du laboratoire de recherches sur le cancer qu\u2019il venait de quitter.<\/p>\n

En 1911, Rous publia un article montrant que de petites quantit\u00e9 de filtrat de sarcome aviaire d\u00e9pourvu de cellules peut transmettre cette tumeur tr\u00e8s m\u00e9tastatique aux esp\u00e8ces sensibles. Loin d\u2019\u00eatre une tumeur spontan\u00e9e, comme on le croyait, le sarcome aviaire est caus\u00e9 par un virus. L\u2019importance de cette d\u00e9couverte \u00e9chappa totalement \u00e0 la communaut\u00e9 scientifique. Dans les ann\u00e9es 1950, il sera \u00e9tabli que le virus du sarcome de Rous est un r\u00e9trovirus ; en m\u00e9decine humaine, ces virus ont une sinistre r\u00e9putation : ils sont responsables du syndrome d\u2019immunod\u00e9ficience acquise (SIDA) et de leuc\u00e9mies ; ils ont aussi un comportement qui parut h\u00e9r\u00e9tique aux biologistes des ann\u00e9es 1950 : ils peuvent, gr\u00e2ce \u00e0 une ADN polym\u00e9rase particuli\u00e8re, appel\u00e9e transcriptase r\u00e9verse, synth\u00e9tiser de l\u2019ADN \u00e0 partir d\u2019une matrice d\u2019ARN, remettant en cause le dogme d\u2019un flux univoque d\u2019information de l\u2019ADN vers l\u2019ARN. Rous fut donc le premier \u00e0 montrer qu\u2019un virus peut \u00eatre l\u2019agent causal d\u2019un cancer. Il essaya, sans succ\u00e8s, de cultiver le virus et d\u2019\u00e9tendre la port\u00e9e de ses r\u00e9sultats aux tumeurs de la souris. Confront\u00e9 \u00e0 la suspicion et aux critiques parfois virulentes de ses confr\u00e8res, il abandonna, en 1915, ses recherches sur le sarcome. Les ann\u00e9es passant, l\u2019importance de la d\u00e9couverte de Rous sur l\u2019agent du sarcome du poulet finit par s\u2019imposer. Apr\u00e8s avoir \u00e9t\u00e9 assailli de critiques, Rous fut couvert de r\u00e9compenses ; il re\u00e7ut le prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine 1966 comme on re\u00e7oit l\u2019extr\u00eame onction \u2013 il avait quatre-vingt-sept ans \u2013 \u00ab for his pioneering research on the link between viruses and cancer.<\/i> \u00bb<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Rous P A Sarcoma of the Fowl Transmissible by an Agent Separable from the Tumor Cells<\/i> (1911). Rous publia son article dans le Journal of Experimental Medicine<\/i>, une prestigieuse revue cr\u00e9\u00e9e par le pathologiste William H. Welch, fondateur de la Johns Hopkins School of Medicine<\/i> et premier pr\u00e9sident du Board of Scientific Directors<\/i> du Rockefeller Institute<\/i>. Rous en deviendra l\u2019\u00e9diteur en 1921 et le restera pendant pr\u00e8s d\u2019un demi-si\u00e8cle.<\/span><\/p>\n

Albert Claude consacra une partie de sa carri\u00e8re scientifique \u00e0 purifier le virus de Rous. Sa vocation pour la canc\u00e9rologie exp\u00e9rimentale est \u00e0 mettre en relation avec un drame familial v\u00e9cu dans son enfance, et li\u00e9 \u00e0 cette maladie. Ayant quitt\u00e9 l\u2019\u00e9cole \u00e0 douze ans, il fut d\u2019abord apprenti, puis dessinateur industriel. Il conservera du contact avec les r\u00e9alit\u00e9s mat\u00e9rielles de l\u2019industrie sid\u00e9rurgique une aptitude particuli\u00e8re \u00e0 ma\u00eetriser les probl\u00e8mes techniques de l\u2019instrumentation scientifique. Claude avait agi pendant la Premi\u00e8re Guerre mondiale pour le compte du British Intelligence Service ;<\/i> il fut d\u00e9cor\u00e9 de la British War Medal, <\/i>avec citation  \u00e0 l\u2019ordre du jour sign\u00e9e par le Marshall<\/i> Sir Douglas Haig et par le ministre de la Guerre Sir Winston Churchill. Le gouvernement belge ayant d\u00e9cr\u00e9t\u00e9 que les anciens combattants pouvaient entrer \u00e0 l\u2019universit\u00e9 sans dipl\u00f4me ni examen d\u2019entr\u00e9e, il entreprit en 1922 des \u00e9tudes de m\u00e9decine \u00e0 l\u2019Universit\u00e9 de Li\u00e8ge. Pour sa th\u00e8se de doctorat, il choisit comme sujet la greffe h\u00e9t\u00e9rologue de cellules canc\u00e9reuses chez le rat, travail pour lequel il obtint de J. A. Murray, directeur des Imperial Cancer Research Laboratories<\/i> \u00e0 Londres, l\u2019envoi d\u2019une souche du sarcome S-37 de la souris. La qualit\u00e9 de son m\u00e9moire lui valut, en 1928, l\u2019octroi d\u2019une bourse de s\u00e9jour d\u2019un an \u00e0 l\u2019Universit\u00e9 de Berlin. Blumenthal, directeur de l\u2019Institut f\u00fcr Krebsforshung<\/i>, \u00e9tait un adepte de la th\u00e9orie bact\u00e9rienne du cancer et pr\u00e9tendait que la tumeur mammaire de la souris \u00e9tait transmissible par injection de bact\u00e9ries. Claude montra que le sang inject\u00e9 aux souris, s\u2019il contenait bien les bact\u00e9ries suspect\u00e9es, renfermait aussi des cellules canc\u00e9reuses circulantes. Il ne lui restait plus qu\u2019\u00e0 plier bagages et \u00e0 chercher un autre laboratoire. Dans celui d\u2019Otto Warburg, au Kaiser Wilhem Institut,<\/i> il s\u2019initia, au contact d\u2019Albert Fischer, \u00e0 la culture des tissus et appliqua ses nouvelles connaissances au sarcome S-37. L\u2019engouement pour la culture des cellules et des fragments de tissus \u00e9tait stimul\u00e9 par l\u2019int\u00e9r\u00eat des praticiens – Montrose T. Burrows \u00e0 la Washington University<\/i>, Alexis Carrel (prix Nobel de Physiologie ou M\u00e9decine, en 1912) au Rockefeller Institute for Medical Research<\/i> – pour les transplantations d\u2019organes. Des fragments de tissus (muscle cardiaque, moelle \u00e9pini\u00e8re) ou des cellules isol\u00e9es \u00e9taient plac\u00e9s dans des milieux de survie contenant un cocktail vari\u00e9 de plasma sanguin, d\u2019extraits d\u2019embryon ou de lymphe. Les tissus conservaient leur vitalit\u00e9. La publication de Ross Granville Harrison (John Hopkins University<\/i>), eut un grand retentissement : les fibres de neuroblastes de grenouille en culture \u00e9taient anim\u00e9es de mouvements.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Harrison RG Observations on the living developing nerve fiber<\/i> (1907)<\/span><\/p>\n

Claude d\u00e9couvrit en 1928 l\u2019article de Peyton Rous sur \u00ab l\u2019agent filtrant capable de transmettre le sarcome du poulet \u00bb. Enthousiasm\u00e9 par sa lecture, il r\u00e9digea un projet de recherche visant \u00e0 isoler le virus et l\u2019envoya \u00e0 Simon Flexner, directeur du Rockefeller Institute<\/i>, responsable du Laboratory for Cancer Research<\/i>, et \u00e9diteur du r\u00e9put\u00e9 Journal of Experimental Medecine<\/i>. Il faut rendre hommage \u00e0 l\u2019ouverture d\u2019esprit de Flexner qui accepta le projet d\u2019un parfait inconnu et lui octroya un poste (assez mal r\u00e9tribu\u00e9) d\u2019assistant volontaire. En 1929, Claude rejoignit le laboratoire de James Murphy (Department of Pathology<\/i>), un \u00e9l\u00e8ve de Peyton Rous qui avait repris en 1920 le flambeau abandonn\u00e9 par son ma\u00eetre en 1915. Claude entreprit en 1930 le laborieux travail d\u2019isolement de \u00ab l\u2019agent filtrable causant le sarcome du poulet \u00bb. En 1936, il entendit parler des travaux de William E. Gye (National Institute for Medical Research, Hampstead<\/i>) sur les sarcomes aviaires et l\u2019emploi de la centrifugation pour en isoler les agents filtrables. Encore \u00e9tudiant en m\u00e9decine, Claude avait d\u00e9j\u00e0 eu recours \u00e0 la centrifugation (avec une centrifugeuse de table actionn\u00e9e \u00e0 la main) pour isoler \u00ab les beaux granules rouge orang\u00e9 des leucocytes \u00e9osinophiles \u00bb pr\u00e9sents dans les tissus canc\u00e9reux et les expectorations des malades. Il pr\u00e9para, un broyat d\u2019embryons de poulets infect\u00e9s par \u00ab l’agent I de la tumeur des poulets \u00bb ; il essaya plusieurs milieux d\u2019homog\u00e9n\u00e9isation : eau distill\u00e9e, solution de chlorure de sodium, tampon phosphate de pH voisin de la neutralit\u00e9. Il soumit le broyat \u00e0 des centrifugations \u00e0 vitesses croissantes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Ledingham JCG, Gye WE On the Nature of the Filterable Tumour-Exciting Agent in Avian Sarcomata<\/i> (1935)<\/p>\n\n\n\n\n
\"chap6-1\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n
Fractionnement d\u2019un broyat de tissu par centrifugation diff\u00e9rentielle<\/b>. Le protocole de fractionnement utilis\u00e9 par Albert Claude conduisait \u00e0 l\u2019isolement de trois fractions particulaires : noyaux, gros granules, petits granules, et d\u2019un surnageant final.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

 <\/p>\n

La centrifugation dite diff\u00e9rentielle s\u00e9pare les particules essentiellement en fonction de leur taille. La rotation du rotor de la centrifugeuse g\u00e9n\u00e8re une force centrifuge qui d\u00e9place les particules \u00e0 une vitesse qui d\u00e9pend de leur volume et, dans une moindre mesure, de leur densit\u00e9. Les vitesses de d\u00e9placement sont calcul\u00e9es en utilisant l\u2019\u00e9quation de Theodor Svedberg (prix Nobel de chimie 1926). Pour d\u00e9terminer les vitesses de rotation du rotor, Claude fit une estimation de la taille des organites \u00e0 s\u00e9parer, principalement les noyaux et les mitochondries. Il obtint ainsi un culot \u00e0 basse vitesse contenant des noyaux et des cellules intactes ou partiellement broy\u00e9es ; un culot \u00e0 moyenne vitesse (\u00ab Large Granules<\/i> \u00bb) form\u00e9 de mitochondries ; un culot \u00e0 haute vitesse (\u00ab Small granules<\/i> \u00bb ou \u00ab Particles<\/i> \u00bb) renfermant les virus qu\u2019il cherchait \u00e0 s\u00e9parer. Ce culot avait un contenu \u00e9lev\u00e9 en \u00ab ribose nucleoprotein complexes<\/i> \u00bb – le g\u00e9nome du virus de Rous est un ARN – et avait conserv\u00e9 un pouvoir infectieux : remis en suspension et inject\u00e9 \u00e0 des poulets ce culot transmettait le sarcome. L\u2019exp\u00e9rience \u00ab contr\u00f4le \u00bb r\u00e9servait une surprise : le culot de Small granules<\/i> obtenu \u00e0 partir d\u2019embryons non infect\u00e9s \u00e9tait d\u00e9pourvu de pouvoir infectieux, comme on pouvait s\u2019y attendre, mais il \u00e9tait g\u00e9latineux et riche en ARN ! Quelle \u00e9tait sa nature ? S\u2019agissait-il d\u2019un nouvel organite subcellulaire ? Claude publia ces r\u00e9sultats en 1938 ; un autre article, publi\u00e9 en 1947 avec Keith R. Porter et Edward G. Pickels, contenait une micrographie \u00e9lectronique montrant les amas de particules virales dans le cytoplasme de cellules infect\u00e9es.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Claude A A Fraction from Normal Chick Embryo Similar to the Tumor-Producing Fraction of Chicken Tumor I<\/i> (1938)
\nClaude A, Porter KR, Pickels EG Electron Microscope Study of Chicken Tumor Cells<\/i> (1947)<\/p>\n

Claude consacra ses efforts \u00e0 l\u2019identification de l\u2019organite riche en ARN pr\u00e9sent dans les Small Granules<\/i>. Il crut d\u2019abord qu\u2019il s\u2019agissait de fragments de mitochondries, mais il acquit rapidement la certitude qu\u2019il s\u2019agissait d\u2019un organite non encore identifi\u00e9. \u00c9tait-il sp\u00e9cifique des cellules d\u2019embryon de poulet ? \u00c9tait-il pr\u00e9sent dans toutes les cellules eucaryotes ? Claude fractionna des tissus normaux et canc\u00e9reux, des tissus animaux et v\u00e9g\u00e9taux et des cellules de levure ; chaque fois, il obtint le m\u00eame culot g\u00e9latineux, transparent, ambr\u00e9, riche en phospholipides et renfermant jusqu\u2019\u00e0 85% de l\u2019ARN total du broyat. Au d\u00e9but des ann\u00e9es 1940, les connaissances sur le contenu en organites de la cellule \u00e9taient limit\u00e9es ; dans un article de 1943, Claude \u00e9num\u00e9rait la liste des composants r\u00e9pertori\u00e9s par les cytologistes : noyau, mitochondries, appareil de Golgi, substance fondamentale et sarcode de Dujardin ! Pour caract\u00e9riser le nouveau composant, il fallait \u00ab remonter \u00bb des Small particles<\/i> (rebaptis\u00e9es \u00ab microsomes \u00bb, en 1943) \u00e0 l\u2019organite dans son contexte cellulaire, c\u2019est-\u00e0-dire, suivre la d\u00e9marche inverse de celle suivie par ses pr\u00e9d\u00e9cesseurs \u2013 Friedrich Miescher, Martin Behrens, Robert Bensley \u2013 qui cherchaient \u00e0 isoler un organite pr\u00e9alablement observ\u00e9 au microscope : le noyau, pour Miescher, les mitochondries dans le cas de Behrens ou de Bensley. Claude mit au point le fractionnement subcellulaire quantitatif<\/b> en s\u2019inspirant de l\u2019approche des chimistes pour \u00e9tablir la composition d\u2019un m\u00e9lange de substances : les constituants chimiques (ARN, phospholipides, azote prot\u00e9ique) et enzymatiques furent mesur\u00e9s dans l\u2019homog\u00e9nat et dans toutes les fractions, de fa\u00e7on \u00e0 \u00e9tablir un bilan comparatif en pourcentage du contenu de l\u2019homog\u00e9nat. <\/p>\n

Claude publia en 1946, dans le Journal of Experimental Medicine<\/i>, son approche exp\u00e9rimentale et sa \u00ab philosophie \u00bb du fractionnement subcellulaire dans deux articles qui constituent l’acte de naissance de la Biologie cellulaire. Il a ainsi fait passer la cytologie d\u2019une approche descriptive – observation au microscope de cellules fix\u00e9es, dosage biochimique dans des pr\u00e9parations de tissus broy\u00e9s \u2013 \u00e0 une recherche quantitative<\/b> des rapports entre structures subcellulaires et fonctions.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Claude A The constitution of protoplasm<\/i> (1943)
\nClaude A Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: I. Problems, methods and preparation of extract<\/i> (1946)
\nClaude A Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: II. Experimental procedures and results<\/i> (1946)<\/p>\n

Dans le m\u00eame laboratoire que Claude (Department of Pathology, Rockefeller Institute<\/i>), Walter Schneider s\u2019int\u00e9ressait \u00e0 la localisation intracellulaire des enzymes respiratoires ; il avait montr\u00e9 que la cytochrome oxydase et la succinoxydase s\u00e9dimentent dans la fraction des gros granules. L\u2019examen microscopique de cette fraction r\u00e9v\u00e9lait la pr\u00e9sence de mitochondries sous forme de granules sph\u00e9riques. L\u2019eau et les solutions salines utilis\u00e9es comme milieux d\u2019homog\u00e9n\u00e9isation provoquaient l\u2019agglutination des organites. Il fallait trouver un milieu respectant la forme allong\u00e9e caract\u00e9ristique des mitochondries dans les cellules examin\u00e9es au microscope. Les deux George, Hogeboom et Palade, qui avaient rejoint le groupe de Claude en 1941 et 1946 respectivement, allaient s\u2019en charger. Hogeboom avait \u00e9tudi\u00e9 la m\u00e9decine et la chimie \u00e0 Washington University<\/i>. Sa motivation dans le choix d\u2019une carri\u00e8re scientifique n\u2019\u00e9tait pas sans rappeler celle de Claude : le p\u00e8re d\u2019Hogeboom \u00e9tait mort des suites d\u2019un cancer. Pendant son s\u00e9jour dans le laboratoire de Robert Chambers (New York University<\/i>), George Palade, m\u00e9decin et anatomiste, fut attir\u00e9 vers la microscopie \u00e9lectronique apr\u00e8s avoir assist\u00e9 \u00e0 une conf\u00e9rence de Claude, un pionnier de cette nouvelle technologie. Hogeboom, Schneider et Palade compar\u00e8rent les m\u00e9rites respectifs de quatre milieux d\u2019homog\u00e9n\u00e9isation sur la morphologie et la colorabilit\u00e9 des mitochondries : solution de NaCl \u00e0 85%, eau distill\u00e9e, saccharose 250 millimolaire (mM) ou 880 mM. C\u2019est dans ce dernier milieu que les mitochondries \u00e9taient les mieux pr\u00e9serv\u00e9es. Finalement, c\u2019est le saccharose 250 mM qui sera retenu comme milieu d\u2019homog\u00e9n\u00e9isation. Le broyage des tissus au mortier fut remplac\u00e9 par l\u2019usage de l\u2019homog\u00e9n\u00e9iseur de Potter et Elvejhem.<\/p>\n

En 1949, Claude quitta New York pour Bruxelles, o\u00f9 il prit la direction de l\u2019Institut Jules Bordet. La caract\u00e9risation du composant riche en ARN restait en chantier. L\u2019hypoth\u00e8se mitochondries \u00e9tant devenue tr\u00e8s improbable, une nouvelle piste fut explor\u00e9e : l\u2019origine des Small Granules<\/i> serait le \u00ab lace-like reticulum<\/i> \u00bb, r\u00e9cemment d\u00e9couvert au microscope \u00e9lectronique. La dispersion du Rockefeller Group<\/i> se poursuivit avec le d\u00e9part de George Hogeboom pour les National Institutes of Health<\/i> \u00e0 Bethesda, o\u00f9 il \u00e9tudia avec Walter Schneider la distribution subcellulaire de nombreux enzymes.<\/p>\n

Albert Claude utilisait comme milieu d\u2019homog\u00e9n\u00e9isation des tissus de l’eau distill\u00e9e ou des solutions salines \u00e0 pH voisin de la neutralit\u00e9 ; le milieu salin pr\u00e9sentait un double inconv\u00e9nient : (i) il provoquait l\u2019agglutination des entit\u00e9s subcellulaire ; (ii) il provoquait \u2013 et l\u2019eau distill\u00e9e encore plus – un choc osmotique qui endommageait les membranes mitochondriales et lib\u00e9rait le contenu de la matrice. Un progr\u00e8s majeur fut accompli avec l’introduction, \u00e0 l\u2019initiative de George Palade, des solutions de saccharose (sucrose). Hogeboom disparut en 1956, \u00e0 quarante-trois ans, en pleine maturit\u00e9 scientifique, apr\u00e8s avoir cr\u00e9\u00e9 le concept d\u2019\u00ab enzyme marqueur \u00bb (d\u2019un organite) qui allait permettre l\u2019interpr\u00e9tation des r\u00e9sultats du fractionnement subcellulaire.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Hogeboom G, Schneider WC, Palade GE Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material<\/i> (1948)
\nHogeboom GH Separation and properties of cell components<\/i> (1951)
\nHogeboom GH, Schneider WC, Striebich MJ Cytochemical studies. V. On the isolation and biochemical properties of liver cell nuclei<\/i> (1952)<\/p>\n

Article de revue : Hogeboom GH, Schneider WC The cytoplasm<\/i> (1952)<\/p>\n

<\/a>\u00ab Lace-like reticulum \u00bb <\/i><\/b><\/span><\/h3>\n

\u00ab Our function is not to provide confirmatory morphological evidence for old concepts, but to define a new morphological background against which old and new physiological data will be interpreted in the future.<\/i> \u00bb<\/i><\/p>\n

George E. Palade<\/i><\/p>\n

Les firmes Siemens et AEG (Allgemeine Elektricit\u00e4ts-Gesellschaft<\/i>) commercialis\u00e8rent leurs microscopes \u00e9lectroniques en transmission en 1939 ; le microscope RCA (Radio Corporation America<\/i>) fut mis sur le march\u00e9 am\u00e9ricain en 1941 ; celui de la firme Philips fut distribu\u00e9 en Europe en 1943. Un industriel new-yorkais, Albert Gessler, ayant eu connaissance des difficult\u00e9s rencontr\u00e9es par Claude pour identifier un virus provoquant un cancer, mit \u00e0 sa disposition le microscope RCA EMB r\u00e9cemment acquis par le d\u00e9partement de recherches d\u2019Interchemical Laboratory<\/i>. Ernest F. Fullam fut charg\u00e9 d\u2019apprendre \u00e0 Claude comment l\u2019utiliser. Claude et Fullam examin\u00e8rent d\u2019abord une pr\u00e9paration de mitochondries de lymphosarcome de rat, des organites dont l\u2019observation au microscope optique avait r\u00e9v\u00e9l\u00e9 la morphologie. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Claude A, Fullam EF An electron microscope study of isolated mitochondria<\/i> (1945)<\/p>\n

Helen P. Thompson et Keith Porter (Rockefeller Institute for Medical Research<\/i>) mirent au point la culture de cellules de poulet sur film de Formvar, ainsi qu\u2019une m\u00e9thode de d\u00e9shydratation des cellules (l\u2019examen au microscope \u00e9lectronique s\u2019effectue sous vide). La micrographie d\u2019un fibroblaste de poulet fix\u00e9 dans les vapeurs d\u2019acide osmique r\u00e9v\u00e9lait la pr\u00e9sence d\u2019un r\u00e9seau de membranes (\u00ab lace-like \u00bb reticulum<\/i>) et des chapelets de corps v\u00e9siculaires (vesicle-like bodies<\/i>) au sein de ce que les cytologistes des ann\u00e9es 1940 et 1950 appelaient \u00ab substance fondamentale \u00bb granuleuse de la cellule, ou \u00ab hyaloplasme \u00bb. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Porter KR, Claude A, Thompson EF A study of tissue culture cells by electron microscopy: Methods and preliminary observations<\/i> (1945)
\nPorter KR, Claude A, Fullam EF A Study of Tissue Culture Cells by Electron Microscopy : Methods and Preliminary Observations<\/i> (1945)
\nPorter KR, Thompson HP Some morphological features of cultured rat sarcoma cells as revealed by electron microscopy<\/i> (1947)
\nPorter KR Observations on a submicroscopic basophilic component of cytoplasm<\/i> (1953)<\/p>\n

En observant au microscope \u00e9lectronique des coupes ultra-fines de tissus, Wilhelm Bernhard et Charles Oberling (Institut du Cancer du Centre National de la recherche scientifique, Villejuif) ont d\u00e9crit un empilement dense de membranes doubles parsem\u00e9es de grains, qu\u2019ils ont d\u00e9nomm\u00e9 \u00ab ergastoplasme \u00bb. Ce terme avait \u00e9t\u00e9 invent\u00e9 par l\u2019histologiste Charles Garnier (du grec ergastis<\/i>, ouvrier). En 1897, il d\u00e9couvrit des zones tr\u00e8s basophiles au sein des cellules, et qui semblaient actives dans des synth\u00e8ses dont on ne connaissait pas la nature. Bernhard et Oberling \u00e9tablirent un lien entre l’ergastoplasme et les microsomes, des organites isol\u00e9s par centrifugation diff\u00e9rentielle d\u2019homog\u00e9nats de tissus. Bernhard fut un pionnier de l\u2019histochimie ultra-structurale associ\u00e9e \u00e0 la microscopie \u00e9lectronique ; il a ainsi montr\u00e9 que les grains associ\u00e9s aux membranes de ce qui deviendrait plus tard le reticulum endoplasmique rugueux, sont sensibles \u00e0 la ribonucl\u00e9ase.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Bernhard W, Haguenau F, Gautier A, Oberling C La structure submicroscopique des \u00e9l\u00e9ments basophiles cytoplasmiques dans le foie, le pancr\u00e9as et les glandes salivaires. \u00c9tude de coupes ultrafines au microscope \u00e9lectronique (1952)
\nBernhard W, Gautier A, Rouiller C La notion d’ergastoplasme et sa contribution \u00e0 l’\u00e9tude de la structure fine du cytoplasme (1954)<\/p>\n

Sur la premi\u00e8re micrographie \u00e9lectronique d\u2019une cellule, le d\u00e9tail des structures cytoplasmiques n\u2019\u00e9taient visibles que sur le bord le plus mince de la pr\u00e9paration mais pas dans la r\u00e9gion plus \u00e9paisse entourant le noyau. Le recours aux coupes de tissus s\u2019imposait. Dans les ann\u00e9es 1940 et 1950, l\u2019\u00e2ge d\u2019or de ce qui ne s\u2019appelait pas encore la Biologie cellulaire a \u00e9t\u00e9 domin\u00e9 par deux personnalit\u00e9s : Keith Porter (Rockefeller Institute, New York <\/i>) et Fritiof Sj\u00f6strand (Karolinska Institutet, Stockholm<\/i>). <\/p>\n

Keith Porter et Frances L. Kallman ont g\u00e9n\u00e9ralis\u00e9 l\u2019usage du t\u00e9troxyde d’osmium comme fixateur ; OsO4<\/sub> est un oxydant puissant qui, en interagissant avec les acides gras des phospholipides, rend les membranes cellulaires opaques aux \u00e9lectrons ; elles apparaissent sous forme de lignes noires sur fond clair. L\u2019acidit\u00e9 provoquant la formation d\u2019artefacts, George Palade, dans le laboratoire de Porter, dilua l\u2019acide osmique dans le tampon ac\u00e9tate\/v\u00e9ronal de Michaelis (pH 7,2 \u00e0 7,6). Le \u00ab milieu de Palade \u00bb, mis au point en 1952, fut largement adopt\u00e9. Porter est aussi le co-inventeur de l’ultra microtome Porter-Blum. C’\u00e9tait le premier appareil fiable utilisant une avance m\u00e9canique (puis thermique) pour produire des coupes de moins de 100 nm d’\u00e9paisseur. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Porter KR, Blum J A study in microtomy for electron microscopy<\/i> (1953)
\nPorter K, Kallman F The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy<\/i> (1953)
\nPalade GE A study of fixation for electron microscopy<\/i> (1952) <\/p>\n

D\u2019autres milieux de fixation des tissus furent propos\u00e9s : John H. Luft (Department of Anatomy, Harvard Medical School<\/i>) pr\u00e9conisa l\u2019emploi du permanganate de potassium, ou de l\u2019acrol\u00e9ine, pour sa grande capacit\u00e9 \u00e0 p\u00e9n\u00e9trer dans les tissus. En 1961, David Sabatini introduisit la glutarald\u00e9hyde, qui pr\u00e9sente l\u2019avantage de pr\u00e9server l\u2019activit\u00e9 des enzymes. La glutarald\u00e9hyde, seule ou m\u00e9lang\u00e9e \u00e0 la paraformald\u00e9hyde, tamponn\u00e9e \u00e0 pH 7,2 – 7.4 (m\u00e9lange de Karnofsky) est utilis\u00e9e comme fixateur primaire. La post-fixation est assur\u00e9e par le t\u00e9troxyde d’osmium. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Luft JH Permanganate\u2014a new fixative for electron microscopy<\/i> (1956)
\nLuft JH The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy<\/i> (1959) <\/p>\n

Pour Fritiof Sj\u00f6strand, un temps de fixation trop long d\u00e9nature les prot\u00e9ines cellulaires ; il a remplac\u00e9 la m\u00e9thode de Porter par une technique avec des temps de fixations courts, \u00e0 basse temp\u00e9rature. Il a d\u00e9velopp\u00e9 un ultramicrotome, \u00e9quip\u00e9 de couteaux de verre polis, r\u00e9put\u00e9 pour sa pr\u00e9cision. Pour l\u2019inclusion des tissus, il a supprim\u00e9 le m\u00e9thyl- ou butyl m\u00e9thacrylate, propos\u00e9s par Newman et coll., qui se solidifient par dessiccation au four. S\u2019\u00e9tant r\u00e9v\u00e9l\u00e9 instable sous un faisceau d\u2019\u00e9lectrons, le m\u00e9thacrylate fut remplac\u00e9 en 1956 par les r\u00e9sines \u00e9poxy Epon ou Araldite.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Newman SB, Borysko E, Swerdlow M New sectioning techniques for light and electron microscopy<\/i> (1949)
\nLatta H, Hartmann JF Use of a Glass Edge in Thin Sectioning for Electron Microscopy<\/i> (1950)
\nSjostrand FS A new microtome for ultrathin sectioning for high resolution electron microscopy<\/i> (1953)
\nLuft JH Improvements in epoxy resin embedding methods<\/i> (1961) <\/p>\n

Ouvrage g\u00e9n\u00e9ral : Sj\u00f6strand FS Electron Microscopy of Cells and Tissues<\/i> (1967) <\/p>\n

Pour couper les \u00e9chantillons inclus dans un milieu solide, Ernest Fullam, chez Interchemical Laboratory<\/i>, avait con\u00e7u un microtome. Keith Porter et Joseph Blum, dans l\u2019atelier du Rockefeller Institute<\/i>, ajout\u00e8rent un m\u00e9canisme d\u2019avance du couteau, pr\u00e9servant la surface du bloc \u00e0 couper, et un r\u00e9servoir de liquide pour recueillir les coupes par flottaison, afin d\u2019\u00e9viter qu\u2019elles ne se recroquevillent avant d\u2019\u00eatre d\u00e9pos\u00e9es sur une grille m\u00e9tallique. Le microtome \u00ab Porter-Blum \u00bb fut achev\u00e9 dans les ann\u00e9es 1950 et largement adopt\u00e9 dans les laboratoires de microscopie \u00e9lectronique. Harrison Latta et J. Francis Hartmann (Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge<\/i>) utilis\u00e8rent des couteaux de verre, bient\u00f4t remplac\u00e9s par des couteaux en diamant, plus chers mais beaucoup plus r\u00e9sistants.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Newman SB, Borysko E, Swerdlow M New sectioning techniques for light and electron microscopy<\/i> (1949)
\nLatta H, Hartmann JF Use of a Glass Edge in Thin Sectioning for Electron Microscopy<\/i> (1950)
\nNewman SB, Borysko E, Swerdlow M New sectioning techniques for light and electron microscopy<\/i> (1949) <\/p>\n\n\n\n\n
\"chap6-2\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n
Reticulum endoplasmique d\u2019une cellule h\u00e9patique. <\/b>RER : reticulum endoplasmique rugueux ; REL reticulum endoplasmiqur lisse.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

 <\/p>\n

Keith Porter et Frances L. Kallman montr\u00e8rent que les \u00e9l\u00e9ments du r\u00e9seau membranaire cytoplasmique sont en continuit\u00e9 entre eux formant ainsi un organite unique. Cet organite polymorphe (saccules, tubules, v\u00e9sicules) a tendance \u00e0 se fragmenter en v\u00e9sicules au cours de l\u2019homog\u00e9n\u00e9isation des tissus. D\u00e8s 1948, Claude avait \u00e9mis l\u2019hypoth\u00e8se que les microsomes d\u00e9rivent du r\u00e9seau membranaire cytoplasmique. Le lien fut \u00e9tabli par George Palade ; il proposa que l\u2019homog\u00e9n\u00e9isation provoque la formation des v\u00e9sicules microsomiales par pincement de la membrane du r\u00e9ticulum (pinching off process<\/i>). D\u2019un diam\u00e8tre moyen de 130 nm, les v\u00e9sicules microsomiales sont lisses (sans ribosomes li\u00e9s) ou rugueuses (avec des ribosomes li\u00e9s). Fait remarquable, elles conservent l\u2019architecture du r\u00e9ticulum endoplasmique, dont la membrane s\u00e9pare le cytoplasme d\u2019un espace interne appel\u00e9 \u00ab lumen \u00bb ou, plus rarement, \u00ab r\u00e9ticuloplasme \u00bb. La face externe des v\u00e9sicules correspond \u00e0 la face cytoplasmique de la membrane ; le contenu v\u00e9siculaire correspond au r\u00e9ticuloplasme et les ribosomes restent li\u00e9s \u00e0 la face externe des v\u00e9sicules microsomiales rugueuses. J. Francis Hartman et Michael L. Watson montr\u00e8rent que la membrane du reticulum est en continuit\u00e9 avec la membrane externe de l\u2019enveloppe nucl\u00e9aire. A cette occasion, apparut pour la premi\u00e8re fois l\u2019appellation \u00ab reticulum endoplasmique \u00bb. Fritiof Sj\u00f6strand et V. Hanzon (Department of Anatomy, Karolinska Institutet, Stockholm<\/i>) compl\u00e9t\u00e8rent la description du r\u00e9seau membranaire cytoplasmique par celle des tubules et des citernes de l\u2019appareil de Golgi.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Porter K, Kallman FL Significance of Cell particulates as seen by electron microscopy<\/i> (1952)
\nPalade GE, Siekevitz P Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study<\/i> (1956)
\nSj\u00f6strand FS, Hanzon V Ultrastructure of Golgi apparatus of exocrine cells of mouse pancreas<\/i> (1954)<\/span><\/p>\n

Jean L. Brachet (Universit\u00e9 libre de Bruxelles) et Torbj\u00f6rn O. Casperson (Karolinska Institutet<\/i>) d\u00e9couvrirent, ind\u00e9pendamment, le r\u00f4le de l\u2019ARN dans la synth\u00e8se des prot\u00e9ines ; les cellules o\u00f9 cette synth\u00e8se est tr\u00e8s active sont riches en ARN. Albert Claude avait montr\u00e9 qu\u2019une grande proportion de l\u2019ARN de la cellule se retrouve dans les microsomes ; leur implication dans la synth\u00e8se prot\u00e9ique fut \u00e9tablie par Henry Borsook (California Institute of Technology<\/i>) et par Tore Hultin (Wenner-Gren Institute for Experimental Biology, Stockholm<\/i>). A la fin des ann\u00e9es 1940, des traceurs radioactifs (14<\/sup>C, 3<\/sup>H, 32<\/sup>P, 35<\/sup>S) furent mis \u00e0 la disposition des biochimistes. Paul C. Zamecnik et coll. (Huntington Laboratories of Harvard University, Massachusetts General Hospital, Boston<\/i>) montr\u00e8rent que chez des rats auxquels ils avaient inject\u00e9 des acides amin\u00e9s radioactifs, la radioactivit\u00e9 est associ\u00e9e aux microsomes. Cyrus P. Barnum et Robert A. Huseby (National Institute of Health, Bethesda<\/i>), et Mary L. Petermann (Sloan Kettering Institute, New York<\/i>) obtinrent par centrifugation \u00e0 haute vitesse d\u2019un surnageant post-microsomial des particules impliqu\u00e9es dans la synth\u00e8se prot\u00e9ique ; les \u00ab ultra microsomes \u00bb de Barnum et les \u00ab macromol\u00e9cules de ribonucl\u00e9oprot\u00e9ine \u00bb de Peterman \u00e9taient plus petits que les v\u00e9sicules microsomiales et avaient un rapport ARN\/prot\u00e9ine plus \u00e9lev\u00e9. En 1953, Palade observa au microscope \u00e9lectronique des grains opaques aux \u00e9lectrons dans le cytoplasme des cellules ; il les appela \u00ab Small Particulate Components<\/i> \u00bb, ou \u00ab Ribonucleoprotein Particles<\/i> \u00bb. Longtemps appel\u00e9s \u00ab grains de Palade \u00bb, ces particules furent rebaptis\u00e9s \u00ab ribosomes \u00bb par Howard M. Dintzis (Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology<\/i>) et par J.M. Robertson, en 1958.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Brachet J La localisation des acides pentosenucl\u00e9iques dans les tissus animaux et les oeufs d\u2019Amphibiens en voie de d\u00e9veloppement (1942)
\nBorsook H, Deasy CL, Haagen-Smit AJ, Keighley G, Lowy PH The uptake in vitro of 14<\/sup>C-labelled glycine, L-leucine, and L-lysine by different components of guinea pig liver homogenate<\/i> (1950). Henry Borsook travaillait dans le D\u00e9partement de biologie fond\u00e9 par Thomas H. Morgan au California Institute of Technology<\/i>, \u00e0 Pasadena.
\nLittlefield JW, Keller EB, Gross J, Zamecnik PC Studies on cytoplasmic ribonucleoprotein particles from the liver of the rat<\/i> (1955)
\nBarnum CP, Huseby RA Some quantitative analyses of the particulate fractions from mouse liver cytoplasm<\/i> (1948)
\nPetermann ML, Hamilton MG An ultracentrifugal analysis of the macromolecular particles of normal and leukemic mouse spleen<\/i> (1952)<\/span><\/p>\n

Alfred Tissi\u00e8res et James Watson (Harvard<\/i>) montr\u00e8rent que le ribosome d\u2019Escherichia Coli<\/i> est dissociable en deux entit\u00e9s, une grande et une petite, compos\u00e9es chacune de prot\u00e9ines et d\u2019ARN. Au terme d\u2019un impressionnant travail d\u2019analyse, Masayasu Nomura et ses associ\u00e9s (Laboratory of Genetics, University of Wisconsin, Madison<\/i>) \u00e9tablirent la composition en ARN et en polypeptides de ces sous-unit\u00e9s ribosomiales. Dans les solutions salines concentr\u00e9es, les sous-unit\u00e9s se dissocient en ARNr et prot\u00e9ines ; il suffit de ramener progressivement le taux de salinit\u00e9 \u00e0 une valeur voisine de celui du cytosol, pour que l\u2019ARNr et les polypeptides s’associent spontan\u00e9ment en ribosomes. Chez Escherichia Coli, la petite sous-unit\u00e9 30S<\/i> est constitu\u00e9e de l\u2019ARNr 16S<\/i> et de 21 prot\u00e9ines ; la grande sous-unit\u00e9 50S<\/i>, des ARNr 5S<\/i> et 23S<\/i> et de 33 prot\u00e9ines. Chez les eucaryotes, la grande sous-unit\u00e9 60S renferme les ARNr 28S<\/i>, 5,8S<\/i> et 5S et 49 prot\u00e9ines ; la petite sous-unit\u00e9 40S<\/i> est constitu\u00e9e de l\u2019ARNr 18S<\/i> et de 33 prot\u00e9ines. La petite sous-unit\u00e9 contient le site de lecture de l\u2019ARNm ; la grande sous-unit\u00e9, poss\u00e8de le site catalytique o\u00f9 se fait la liaison peptidique (Peptidyl-transferase center<\/i>). Walter Gilbert (Harvard University<\/i>, prix Nobel de chimie 1980), co-d\u00e9couvreur de l\u2019ARNt avec Mahlon Hoagland, montra que les peptides n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9s sont li\u00e9s \u00e0 la grosse sous-unit\u00e9 ribosomiale, et que l\u2019association des ribosomes en polysomes augmente consid\u00e9rablement la vitesse de lecture de l\u2019ARNm et de synth\u00e8se des polypeptides. Dans les cellules tumorales en culture, o\u00f9 le taux de division est \u00e9lev\u00e9, l\u2019ARNr peut repr\u00e9senter jusqu\u2019\u00e0 80% de l\u2019ARN total des cellules ; les 20% restant sont des ARN de transfert (ARNt), des ARN messagers (ARNm), des ribonucl\u00e9oprot\u00e9ines non ribosomiales et des ARN divers. Un progr\u00e8s majeur dans l\u2019\u00e9tude de la synth\u00e8se prot\u00e9ique fut accompli, au d\u00e9but des ann\u00e9es 1950, avec la mise au point d\u2019un syst\u00e8me acellulaire constitu\u00e9 d\u2019un surnageant de foie de rat additionn\u00e9 d\u2019acides amin\u00e9s, d\u2019ATP et d\u2019une mixture r\u00e9g\u00e9n\u00e9rant l\u2019ATP. Dans le laboratoire de Zamecnik, la quantit\u00e9 de peptides synth\u00e9tis\u00e9s in vitro<\/i> \u00e9tait tr\u00e8s faible. K. Mc Qillen obtint, en 1960, des r\u00e9sultats plus convaincants avec des ribosomes d\u2019Escherichia coli<\/i> incub\u00e9s en pr\u00e9sence d\u2019acides amin\u00e9s radioactifs.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Tissi\u00e8res A, Watson JD Ribonucleoprotein particles from Escherichia Coli<\/i> (1958)
\nHosokawa K, Fujimura RK, Nomura M Reconstitution of functionally active ribosomes from inactive subparticles and proteins<\/i> (1966)
\nPalade GE A small particulate component of the cytoplasm<\/i> (1955) <\/span><\/p>\n

<\/a>Un exploit scientifique :
\nla structure cristallographique du ribosome<\/b><\/span><\/h3>\n

Former ‘Village Fool’ Takes the Prize<\/i><\/p>\n

The Jerusalem Post<\/i><\/p>\n

Dans les ann\u00e9es 1970 et 1980, un vif d\u00e9bat opposait les sp\u00e9cialistes des ribosomes : s\u2019agissait-il d\u2019un organite stable et structur\u00e9 ? ou d\u2019une entit\u00e9 ouverte, flexible et changeant de conformation au cours de la synth\u00e8se prot\u00e9ique ? Si tel \u00e9tait le cas, l\u2019id\u00e9e d\u2019en \u00e9tablir la structure cristallographique \u00e9tait chim\u00e9rique. Alexander S. Spirin (Institute of Protein Research, Academy of Sciences of the USSR, Pushchino<\/i>), ardent d\u00e9fenseur de la premi\u00e8re option, avait d\u00e9montr\u00e9 par des m\u00e9thodes biophysiques rigoureuses que dans les conditions physiologiques, le ribosome est une structure stable, compacte et organis\u00e9e; il ouvrait ainsi la voie aux rares kamikazes qui tenteraient d\u2019\u00e9tablir sa structure tridimensionnelle. Ce fut le cas de la cristallographe Ada E. Yonath (Weizmann Institute of Science, Rehovot<\/i>).<\/p>\n

Dans les ann\u00e9es 1980, son projet de cristalliser des ribosomes se heurta \u00e0 un scepticisme quasi g\u00e9n\u00e9ral. Les sous-unit\u00e9s ribosomales sont de machines mol\u00e9culaires volumineuses form\u00e9es de dizaines de milliers d\u2019atomes; de plus, elles sont d\u00e9pourvues de sym\u00e9trie interne (autant qu\u2019on pouvait le savoir); enfin, les ribosomes sont des entit\u00e9s fragiles qui supportent mal les conditions d\u00e9naturantes de la cristallisation et de l\u2019analyse aux rayons X. Yonath eut l\u2019id\u00e9e de g\u00e9nie d\u2019utiliser comme mat\u00e9riel biologique un organisme thermophile; si Bacillus stearothermophilus<\/i> est capable de survivre dans un milieu hostile, ses ribosomes devraient \u00eatre \u00e0 m\u00eame de supporter le processus de cristallisation sans se d\u00e9sagr\u00e9ger. Si tel fut bien le cas, Yonath eut la d\u00e9sillusion de constater que les cristaux obtenus \u00e9taient d\u00e9truits au cours de l’analyse aux rayons X. Ramen\u00e9e au point de d\u00e9part, Yonath eut la chance de b\u00e9n\u00e9ficier du soutien de Heinz-G\u00fcnter Wittmann, directeur du Max-Planck-Institut f\u00fcr Molekulare Genetik, \u00e0 Berlin-Dahlem<\/i>. Seuls une infrastructure et un \u00e9quipement de la qualit\u00e9 de ceux du Max Planck Institute<\/i> pouvaient offrir \u00e0 Yonath les ressources n\u00e9cessaires pour poursuivre son projet : cultures de masse des bact\u00e9ries, production en grandes quantit\u00e9s de ribosomes de qualit\u00e9 cristallographique. Ses travaux prirent un tournant d\u00e9cisif lorsqu\u2019elle d\u00e9couvrit le moyen de r\u00e9duire drastiquement les dommages caus\u00e9s par les rayons X, en d\u00e9veloppant une m\u00e9thode d\u2019analyse des cristaux \u00e0 des temp\u00e9ratures cryog\u00e9niques. L\u2019article d\u00e9crivant l\u2019approche technique r\u00e9volutionnaire de la cryo-cristallographie dans l’azote liquide \u00e0 \u2212185\u2218<\/sup>C ne fut publi\u00e9 qu\u2019en 1989.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Hope H, Frolow F, von B\u00f6hlen K, Makowski I, Kratky C, Halfon Y, Danz H, Webster P, Bartels KS, Wittmann HG, Yonath A Cryocrystallography of Ribosomal Particles<\/i> (1989)<\/p>\n

A Moscou, Alexander Spirin et son \u00e9quipe de l\u2019Institute of Protein Research<\/i> avaient mis au point des m\u00e9thodes rigoureuses pour isoler des ribosomes d’une puret\u00e9 absolue, tout en maintenant leur int\u00e9grit\u00e9 fonctionnelle. Leurs protocoles de centrifugation et de fractionnement servaient de r\u00e9f\u00e9rence dans tous les laboratoires occidentaux. Dans les ann\u00e9es 1980, malgr\u00e9 les vives tensions g\u00e9opolitiques en Europe dues \u00e0 la pr\u00e9sence du Rideau de Fer, Spirin r\u00e9ussit \u00e0 maintenir le contact avec Berlin et Rehovot. Des chercheurs de Pushchino<\/i> – Stanislav Vasilyev et Mikhail Garber – ont travaill\u00e9 \u00e0 Berlin. Spirin a fourni aux \u00e9quipes de Berlin et de Rehovot des pr\u00e9parations de ribosomes de Bacillus stearothermophilus<\/i> biologiquement actifs, d’une stabilit\u00e9 et d’une puret\u00e9 exceptionnelles. En 1980, parut une premi\u00e8re publication de Yonath d\u00e9crivant la cristallisation de la sous-unit\u00e9 50S de Bacillus stearothermophilus<\/i>. Wittmann avait engag\u00e9 non seulement les ressources de son Institut dans un projet auquel ses pairs ne croyaient pas (les demandes de financement de Yonath \u00e9taient souvent rejet\u00e9es), mais aussi son prestige d\u2019expert mondialement reconnu de la cartographie des prot\u00e9ines ribosomales; il cosigna les premi\u00e8res publications scientifiques de Yonath. Dans celle de 1982, la taille des cristaux \u00e9tait suffisante pour l\u2019analyse par diffraction aux rayons X.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Yonath A, Miissig J, Tesche H, Lorenz S, Erdmann VA, Wittmann HG Characterization of crystals of small ribosomal subunits<\/i> (1980)
\nYonath A, Khavitch G, Tesche B, M\u00fcssig J, Lorenz S, Erdmann VA, Wittmann HG The crystallization of the 50S ribosomal subunits from Bacillus stearothermophilus<\/i> (1982)<\/p>\n

Les travaux de Yonath allaient conna\u00eetre un autre tournant d\u00e9cisif : au milieu des ann\u00e9es 1980, elle changea de mat\u00e9riel biologique, passant de la bact\u00e9rie thermophile Bacillus stearothermophilus<\/i> \u00e0 une arch\u00e9e de la Mer Morte vivant dans des conditions de salinit\u00e9 extr\u00eames : Halobacterium marismortui<\/i>, et dont les ribosomes allaient se r\u00e9v\u00e9ler extr\u00eamement stables. Au fil des ann\u00e9es, Yonath obtint des cristaux diffractant \u00e0 des r\u00e9solutions toujours plus \u00e9lev\u00e9es : 15 \u00e0 18 \u00c5 en 1984, 6 \u00c5 en 1987, 4,5 \u00c5 en 1999, jusqu\u2019\u00e0 la r\u00e9solution atomique : 3,1 \u00c5 en 2001.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Shevack A, Gewitz HS, Hennemann B, Yonath A, Wittmann HG Characterization and crystallization of ribosomal particles from Halobacterium marismortui<\/i> (1985)
\nYonath A, Saper MA, Frolow F, Makowski I, Whittmann HG Characterization of single crystals of the large ribosomal particles from a mutant of Bacillus stearothermophilus<\/i> (1986)
\nMakowski I, Frolow F, Saper MA, Shoam M, Whittmann HG, Yonath A Single crystals of large ribosomal particles from Halobacterium marismortui diffract to 6 \u00c5<\/i> (1987)
\nGlotz C, M\u00fcssig J, Gewitz HS, Makowski I, Arad T, Yonath A, Whittmann HG Three-dimensional crystals of ribosomes and their subunits from eu- and archabacteria<\/i> (1987)
\nSchluenzen F, Tocilj A, Zarivach R, Harms J, Gluehmann M, Janell D, Bashan A, Bartels H, Agmon I, Franceschi F, Yonath A Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 \u00c5 resolution<\/i> (2000)<\/p>\n

En 1987 et 1988, les chercheurs de l\u2019Institute of Protein Research, Academy of Sciences of the USSR, Pushchino<\/i> et de I\u2019Institute of Crystallography, Academy of Sciences of the USSR, Moscow<\/i> publi\u00e8rent, dans une s\u00e9rie d\u2019articles, leurs r\u00e9sultats sur la cristallographie des ribosomes 30S et 70S de Thermus thermophilus<\/i>. Un sommet de la biologie ultrastructurale fut atteint lorsqu\u2019un \u00e9l\u00e8ve de Spirin, Marat Yusupov, et Gulnara Yusupova, dans le laboratoire d’Harry Noller (University of California, Santa Cruz<\/i>), r\u00e9v\u00e9l\u00e8rent la premi\u00e8re structure d\u2019un ribosome complet (70S) : pour la premi\u00e8re fois, l\u2019on put voir comment les sous-unit\u00e9s 30S et 50S interagissent entre elles par des ponts, et leur interaction avec l’ARNm et les ARNt.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Trakhanov SD, Yusupov MM, Agalarov SC, Garber MB, Ryazantsev SN, Tischenko SV, Shirokov VA Crystallization of 70 S ribosomes and 30 S ribosomal subunits from Thermus thermophilus<\/i> (1987)
\nYusupov MM, Trakhanov SD, Barynin VV, Borovyagin VL, Gradov OM, Spirin AS Crystallization of 30S subunits of ribosomes from Thermus thermophilus<\/i> (1987)
\nYusupov MM, Tischenko SV, Trakhanov SD, Ryazantsev SN, Garber MB A new crystallin form of 30S ribosomal subunits from Thermus thermophilus<\/i> (1988)
\nYusupov MM, Yusupova GZ, Baucom A, Lieberman K, Earnest TN, Cate JH, Noller HF Crystal structure of the ribosome at 5.5 \u00c5 resolution<\/i> (2001)<\/p>\n

La citation en exergue de ce paragraphe rappelle que ses coll\u00e8gues traitaient Ada Yonath de \u00abfolle du village\u00bb. Lorsque, en 2009, elle re\u00e7ut le prix Nobel de chimie, il y avait un grand absent \u00e0 la c\u00e9r\u00e9monie de r\u00e9ception : Heinz-G\u00fcnter Wittmann, le visionnaire de la biologie ultra-structurale. Le directeur du Max-Planck-Institut<\/i>, qui avait permis \u00e0 Yonath de traverser le d\u00e9sert, \u00e9tait d\u00e9c\u00e9d\u00e9 en 1990, \u00e0 l\u2019\u00e2ge de 63 ans.<\/p>\n

Alexander Spirin et Ada Yonath avaient ouvert la voie de l\u2019analyse cristallographique des ribosomes, d\u00e9couvert le mat\u00e9riel biologique, invent\u00e9 les outils. Plusieurs groupes s\u2019y engouffr\u00e8rent, parmi lesquels ceux de Thomas A. Steitz et Peter B. Moore (Howard Hughes Medical Institute, Yale University<\/i>) et de Venkatraman Ramakrishnan (Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Cambridge<\/i>). Steitz et Moore r\u00e9solurent la structure cristallographique de la sous-unit\u00e9 50S \u00e0 9 \u00c5 (1998) puis \u00e0 5 \u00c5 (1999) et 2,4 \u00c5 (2000). Pr\u00e9alablement, Moore avait utilis\u00e9 la diffusion des neutrons aux petits angles (Small-angle neutron scattering<\/i>) pour faire une cartographie tridimensionnelle des 21 prot\u00e9ines de la petite sous-unit\u00e9 du ribosome d\u2019Escherichia coli<\/i>. Ramakrishnan \u00e9lucida la structure de la sous-unit\u00e9 30S \u00e0 5,5 \u00c5 (1999) puis \u00e0 3 \u00c5 (2000). Conna\u00eetre la structure atomique des ribosomes est d\u2019un int\u00e9r\u00eat consid\u00e9rable, non seulement en biologie fondamentale mais aussi en th\u00e9rapeutique : les ribosomes bact\u00e9riens sont la cible de la majorit\u00e9 des antibiotiques utilis\u00e9s en m\u00e9decine humaine et animale. Venkatraman Ramakrishnan et Thomas Steitz partag\u00e8rent avec Yonath le prix Nobel de Chimie 2009.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Capel MS, Moore PB Quaternary structure of the small ribosomal subunit of Escherichia Coli determined by neutron diffraction<\/i> (1988)
\nBan N, Freeborn B, Nissen P, Penczek P, Grassucci RA, Sweet R, Frank J, Moore PB, Steitz TA A 9 \u00c5 resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit<\/i> (1998)
\nBan N, Nissen P, Hansen J, Moore PB, Steitz TA The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 \u00c5 resolution<\/i> (2000)
\nWimberly BT, Brodersen DE, Clemons WM, Morgan-Warren RJ, Carter AP, Vonrhein C, Hartsch T, Ramakrishnan V Structure of the 30S ribosomal subunit<\/i> (2000)<\/p>\n\n\n\n\n
\"chap6-3\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n
Ribosome des cellules eucaryotes<\/b>. Il est form\u00e9 de l\u2019association de deux sous-unit\u00e9s, la petite (40S<\/i>), qui d\u00e9chiffre les codons de l\u2019ARNm, et la grosse (60S<\/i>), qui catalyse la r\u00e9action peptidyl transf\u00e9rase qui ajoute un acide amin\u00e9 \u00e0 la cha\u00eene peptidique naissante. L\u2019ARN 5S<\/i> est synth\u00e9tis\u00e9 dans le nucl\u00e9oplasme par l\u2019ARN polym\u00e9rase III ; les ARNr 28S<\/i>, 5,8S<\/i> et 18S<\/i> sont synth\u00e9tis\u00e9s dans le nucl\u00e9ole par l\u2019ARN polym\u00e9rase I, et les prot\u00e9ines, par les ribosomes libres cytoplasmiques. L\u2019ARN 5S<\/i> et les prot\u00e9ines ribosomiales p\u00e9n\u00e8trent dans le noyau par les pores nucl\u00e9aires et s\u2019associent aux pr\u00e9ARN dans le nucl\u00e9ole.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

 <\/p>\n

<\/a>Reticulum endoplasmique et synth\u00e8se prot\u00e9ique<\/b><\/span><\/h3>\n

La synth\u00e8se prot\u00e9ique d\u00e9bute dans le cytosol par l\u2019association de l\u2019ARNm et de la petite sous-unit\u00e9 ribosomale. Masayasu Nomura (Institute for Enzyme Research at the University of Wisconsin<\/i>) montra que cette premi\u00e8re \u00e9tape est imm\u00e9diatement suivie de l\u2019ancrage de la grosse sous-unit\u00e9, aboutissant ainsi \u00e0 la formation d\u2019un ribosome fonctionnel. C\u2019est la phase d\u2019initiation. Avec la traduction de l\u2019ARNm par le ribosome, commence l\u2019\u00e9longation du polypeptide. La lecture codon par codon des instructions port\u00e9es par l\u2019ARNm entra\u00eene la s\u00e9lection d\u2019un acide amin\u00e9 qui s\u2019ajoute \u00e0 la cha\u00eene peptidique naissante. La peptidyl-transf\u00e9rase ribosomiale catalyse le transfert de la cha\u00eene peptidique sur l\u2019acide amin\u00e9 choisi (li\u00e9 \u00e0 son ARNt sp\u00e9cifique sous forme d\u2019aminoacyl ARNt). La terminaison de la traduction a lieu lorsque le d\u00e9placement du ribosome sur l\u2019ARNm l\u2019am\u00e8ne devant un codon stop, indiquant la fin du message traduit. L\u2019ARNm se d\u00e9tache et le ribosome se dissocie en sous-unit\u00e9s. Raymond O.R. Kaempfer, Matthew S. Meselson et Heschel J. Raskas (The Biological Laboratories, Harvard University, Cambridge<\/i>) ont d\u00e9crit le cycle d\u2019association des sous-unit\u00e9s en ribosomes fonctionnels, et de dissociation des ribosomes en sous-unit\u00e9s. Pour diff\u00e9rencier les ribosomes \u00ab anciens \u00bb des ribosomes et sous-unit\u00e9s nouvellement synth\u00e9tis\u00e9s, ils firent cro\u00eetre Escherichia coli<\/i> dans un milieu contenant les isotopes \u00ab lourds \u00bb 13<\/sup>C du carbone, 15<\/sup>N de l\u2019azote et 3<\/sup>H de l\u2019hydrog\u00e8ne. Les bact\u00e9ries renfermant les ribosomes 70S<\/i> \u00ab lourds \u00bb marqu\u00e9s au 13<\/sup>C, 15<\/sup>N et 3<\/sup>H furent transf\u00e9r\u00e9es dans un milieu de culture sans isotopes et incub\u00e9es le temps n\u00e9cessaire \u00e0 la synth\u00e8se de nouveaux ribosomes. Apr\u00e8s broyage des cellules, la centrifugation en gradient de densit\u00e9 permit de s\u00e9parer trois bandes distinctes : une bande dense de ribosomes lourds (13<\/sup>C, 15<\/sup>N, 3<\/sup>H), une bande de densit\u00e9 interm\u00e9diaire de ribosomes dont seule la grosse (50S<\/i>), ou la petite (30S<\/i>) sous-unit\u00e9 \u00e9taient marqu\u00e9es, et une bande \u00ab l\u00e9g\u00e8re \u00bb de ribosomes 70S<\/i>.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Traub P, Nomura M Structure and function of E. coli ribosomes, V. Reconstitution of functionally active 30S ribosomal particles from RNA and proteins<\/i> (1968)
\nKaempfer ROR, Meselson MS, Raskas HJ Cyclic dissociation into stable subunits and re-formation of ribosomes during bacterial growth <\/i>(1968)<\/p>\n

La synth\u00e8se prot\u00e9ique est un processus centralis\u00e9 : en 1972, Michael Rosbash (Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge<\/i>, prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine 2017) montra que la traduction d\u00e9bute toujours sur les polysomes cytosoliques ; elle se poursuit dans le cytosol pour les prot\u00e9ines \u00ab domestiques \u00bb cytosoliques, nucl\u00e9aires, nucl\u00e9olaires et peroxysomiales, pour certaines prot\u00e9ines mitochondriales ou chloroplastiques ; elle se poursuit sur les polysomes li\u00e9s au r\u00e9ticulum endoplasmique (reticulum endoplasmique rugueux) pour les prot\u00e9ines membranaires du reticulum, du complexe de Golgi, des lysosomes, de la membrane plasmique, et pour les prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires stock\u00e9es dans les granules de s\u00e9cr\u00e9tion et export\u00e9es hors de la cellule. Le site o\u00f9 une prot\u00e9ine exerce sa fonction est donc g\u00e9n\u00e9ralement diff\u00e9rent du site de synth\u00e8se, ce qui implique un transport de prot\u00e9ines entre les deux sites. Les cellules qui fabriquent de grandes quantit\u00e9s de prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires (cellules pancr\u00e9atiques, h\u00e9patocytes, plasmocytes, fibroblastes) poss\u00e8dent un r\u00e9ticulum endoplasmique rugueux d\u00e9velopp\u00e9. Les cellules des procaryotes ou les r\u00e9ticulocytes (les globules rouges du sang), qui fabriquent essentiellement des prot\u00e9ines \u00ab domestiques \u00bb, sont d\u00e9pourvues de syst\u00e8me endomembranaire ; leurs ribosomes sont libres dans le milieu intracellulaire.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Rosbash M Formation of membrane-bound polyribosomes<\/i> (1972)<\/span><\/p>\n

Apr\u00e8s la d\u00e9couverte des microsomes par Albert Claude et la caract\u00e9risation morphologique du reticulum endoplasmique par Keith Porter et George Palade, celui-ci et ses collaborateurs entreprirent une s\u00e9rie de travaux pour \u00e9lucider la fonction de cet organite dans la cellule. Palade choisit comme mat\u00e9riel exp\u00e9rimental les cellules des acini pancr\u00e9atiques (chez le cobaye). Le pancr\u00e9as est une glande annexe du tube digestif, form\u00e9e de tissu endocrine (les \u00eelots de Langherans) et de tissu exocrine, constitu\u00e9 d\u2019acinis de cinq \u00e0 dix cellules qui synth\u00e9tisent et exportent des enzymes dig\u00e9rant les acides nucl\u00e9iques (DNAse, RNAse), les prot\u00e9ines (trypsinog\u00e8ne, chymotrypsinog\u00e8ne, procaboxy-peptidases, \u00e9lastase), les lipides (lipase, phospholipase A2) et les hydrates de carbone (amylase). Il existe un parall\u00e8le entre l\u2019activit\u00e9 s\u00e9cr\u00e9toire \u00e9lev\u00e9e du pancr\u00e9as, la pr\u00e9sence, dans les cellules acineuses d\u2019un reticulum endoplasmique particuli\u00e8rement bien d\u00e9velopp\u00e9, et de nombreux granules de s\u00e9cr\u00e9tion (grains de zymog\u00e8nes) ; ils s\u2019accumulent au p\u00f4le apical avant de d\u00e9verser leur contenu en enzymes dans des canalicules aboutissant au canal pancr\u00e9atique (canal de Wirsung) et \u00e0 la portion ant\u00e9rieure de l\u2019intestin gr\u00eale (duod\u00e9num). <\/p>\n

Philip Siekevitz rejoignit en 1954 le laboratoire de Palade et y introduisit la technique de synth\u00e8se prot\u00e9ique in vitro apprise dans le laboratoire de Paul Zamecnik (Huntington Laboratories, Harvard University, Massachusetts General Hospital<\/i>), un pionnier des travaux dans ce domaine. Palade et Siekevitz \u00e9lucid\u00e8rent le r\u00f4le des \u00ab grains de Palade \u00bb (ribosomes) pr\u00e9sents dans le cytoplasme des h\u00e9patocytes et des cellules acineuses, en combinant, fractionnement subcellulaire, examen au microscope \u00e9lectronique et biochimie. Au cours de ces travaux, Palade imagina le m\u00e9canisme de \u00ab pinching off<\/i> \u00bb pour expliquer comment la fragmentation du reticulum endoplasmique au cours du broyage des tissus, aboutit \u00e0 la formation des v\u00e9sicules microsomiales ; la pr\u00e9sence de \u00ab ribonucl\u00e9oprot\u00e9ines \u00bb (ribosomes) \u00e0 leur surface des microsomes rugueux prouve qu\u2019elles ont conserv\u00e9 la m\u00eame polarit\u00e9 que l\u2019organite. Palade et Siekevitz montr\u00e8rent aussi que les microsomes rugueux sont le site de synth\u00e8se des enzymes pancr\u00e9atiques. L\u2019approche exp\u00e9rimentale consistait \u00e0 injecter des acides amin\u00e9s marqu\u00e9s puis \u00e0 d\u00e9tecter le marquage dans les fractions subcellulaires.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Palade GE, Siekevitz P Liver microsomes: an integrated morphological and biochemical study<\/i> (1956)
\nPalade GE, Siekevitz P Pancreatic microsomes: an integrated morphological and biochemical study<\/i> (1956)
\nSiekevitz P, Palade GE A cyto-chemical study on the pancreas of the guinea pig. III. In vivo incorporation of leucine-1-C14 into the proteins of cell fractions<\/i> (1958)
\nSiekevitz P, Palade GE A cytochemical study on the pancreas of the guinea pig. IV. Chemical and metabolic investigation of the ribonucleoprotein particles<\/i> (1959)
\nSiekevitz P, Palade GE A cytochemical study on the pancreas of the guinea pig. 5. In vivo incorporation of leucine-1-C14 into the chymotrypsinogen of various cell fractions<\/i> (1960)<\/span><\/p>\n

Pour suivre le sort des prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires dans les cellules acineuses pancr\u00e9atiques – synth\u00e8se, transport intracellulaire, stockage dans des granules, d\u00e9charge \u2013 Lucien Caro et Palade utilis\u00e8rent deux techniques exp\u00e9rimentales : le radiomarquage suivi de chasse (pulse chase experiment<\/i>) et la microscopie optique ou \u00e9lectronique combin\u00e9e \u00e0 la radio-autoradiographie ; le marquage des prot\u00e9ines \u00e0 la 3<\/sup>H-leucine se retrouve dans le reticulum endoplasmique rugueux (apr\u00e8s 5 minutes), puis dans le Golgi (20 minutes) et les grains de zymog\u00e8ne (60 minutes). Comment se fait le transport des prot\u00e9ines n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9es entre ces compartiments cellulaires ? Pour tester l\u2019hypoth\u00e8se d\u2019un transport par des v\u00e9sicules localis\u00e9es \u00e0 la p\u00e9riph\u00e9rie du Golgi, James Jamieson et Palade ont analys\u00e9 la cin\u00e9tique du transport des prot\u00e9ines pancr\u00e9atiques n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9es en reprenant l\u2019approche exp\u00e9rimentale de Caro : marquage avec de la 14<\/sup>C-leucine suivi d\u2019incubation dans un milieu de chasse (pulse chase<\/i>) pendant 7, 17 et 57 minutes ; fractionnement subcellulaire des tranches de tissus incub\u00e9es par centrifugation en gradient de densit\u00e9 pour isoler les microsomes lisses (renfermant les \u00e9l\u00e9ments du Golgi) et microsomes rugueux. Ces exp\u00e9riences mirent en \u00e9vidence l\u2019existence d\u2019une voie s\u00e9cr\u00e9toire.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Caro LG, Palade GE Protein synthesis, storage and discharge in the pancreatic exocrine cell. An autoradiographic study<\/i> (1964)
\nJamieson JD, Palade GE Role of the Golgi complex in the intracellular transport of secretory proteins<\/i> (1966)
\nJamieson JD, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic acinar cell. I. Role of the peripheral elements of the Golgi complex<\/i> (1967)
\nJamieson JD, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell. I. Role of the peripheral elements of the Golgi complex<\/i> (1967)
\nJamieson JG, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell. II. Transport to Condensing Vacuoles and Zymogen Granules<\/i> (1967)<\/span><\/p>\n

Parall\u00e8lement \u00e0 ces travaux, David Sabatini menait, dans le laboratoire de Palade, des \u00e9tudes sur les ribosomes li\u00e9s \u00e0 la membrane du reticulum endoplasmique. En 1966, Sabatini, Colin Redman et G\u00fcnter Blobel compar\u00e8rent l\u2019efficacit\u00e9 de divers solutions pour d\u00e9tacher les ribosomes des microsomes rugueux : chlorure de potassium, pyrophosphate de sodium, \u00e9thyl\u00e8ne diamine t\u00e9tra-ac\u00e9tate (EDTA). Ces solut\u00e9s d\u00e9placent ou \u00ab ch\u00e9latent \u00bb le Mg2+<\/sup>, un cation dont la pr\u00e9sence est n\u00e9cessaire \u00e0 l\u2019ancrage du ribosome \u00e0 la membrane. Le coefficient de s\u00e9dimentation des particules d\u00e9tach\u00e9es est mesur\u00e9 par centrifugation zonale dans une centrifugeuse analytique. Le lavage par une solution d\u2019EDTA d\u00e9tache d\u2019abord la petite sous-unit\u00e9 (+\/- 32 S<\/i>) ; en augmentant progressivement la concentration en EDTA, on d\u00e9tache les grosses sous-unit\u00e9s (+\/- 47 S<\/i>) surtout si l\u2019on fait suivre le lavage \u00e0 l\u2019EDTA par un traitement par le d\u00e9soxycholate. M\u00eame dans ces conditions, une certaine proportion de grosses sous-unit\u00e9s restent fix\u00e9es \u00e0 la membrane. Apr\u00e8s incubation en pr\u00e9sence de 3<\/sup>H-leucine, le marquage est majoritairement associ\u00e9 aux grosses sous-unit\u00e9s r\u00e9sistantes \u00e0 l\u2019EDTA. Les ribosomes sont li\u00e9s \u00e0 la membrane du r\u00e9ticulum endoplasmique par leur grosse sous-unit\u00e9 ; l\u2019ion Mg2+<\/sup> joue un r\u00f4le dans cette liaison.<\/p>\n

La puromycine est un antibiotique dont la formule chimique comporte principalement une ad\u00e9nosine li\u00e9e \u00e0 une tyrosine dim\u00e9thyl\u00e9e ; la structure de cet antibiotique rappelle celle de l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 3\u2019 d\u2019un aminoacyl ARNt ; il se fixe sur le site P du ribosome. La cha\u00eene peptidique naissante, transf\u00e9r\u00e9e sur le site P, se lie \u00e0 la puromycine. La phase d\u2019\u00e9longation avorte et le polypeptide li\u00e9 \u00e0 la puromycine se d\u00e9tache du ribosome. Sabatini montra que l\u2019addition de puromycine \u00e0 une solution de chlorure de potassium d\u00e9tache la quasi-totalit\u00e9 des ribosomes li\u00e9s \u00e0 la membrane. Le peptide naissant, d\u00e9tach\u00e9 pr\u00e9matur\u00e9ment du ribosome et li\u00e9 \u00e0 la puromycine, est d\u00e9charg\u00e9 dans la lumi\u00e8re du reticulum endoplasmique. La cha\u00eene polypeptidique naissante participe \u00e0 la liaison du ribosome \u00e0 la membrane. La d\u00e9charge vectorielle du polypeptide dans le lumen se fait probablement par un canal transmembranaire qui pourrait \u00eatre en continuit\u00e9 avec celui qui traverse la grosse sous-unit\u00e9 et qui fut observ\u00e9 en 1966 au microscopie \u00e9lectronique, apr\u00e8s coloration n\u00e9gative, par David Sabatini, Yutaka Tashiro et George Palade. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Sabatini DD, Tashiro Y, Palade GE On the attachment of ribosomes to microsomal membranes<\/i> (1966)<\/span><\/p>\n

David D. Sabatini et G\u00fcnter Blobel (Rockefeller University, New York<\/i>) montr\u00e8rent que dans un syst\u00e8me de synth\u00e8se prot\u00e9ique in vitro, en pr\u00e9sence de microsomes rugueux, l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale des polypeptides naissants est prot\u00e9g\u00e9e contre une hydrolyse prot\u00e9olytique par la trypsine ou la chymotrypsine ; la grosse sous-unit\u00e9 ribosomiale et la cha\u00eene polypeptidique naissante sont en contact \u00e9troit avec la membrane ; l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale du polypeptide participerait \u00e0 la liaison du ribosome \u00e0 la membrane. Deux r\u00e9sultats ont conduit \u00e0 se poser une s\u00e9rie de questions : (i) il y a dans le cytoplasme deux pools de ribosomes ; (ii) ce ne sont pas les m\u00eames ARNm qui sont traduits par les ribosomes libres ou par les ribosomes li\u00e9s \u00e0 la membrane ; (iii) on n\u2019a pas d\u00e9tect\u00e9 de diff\u00e9rence de composition entre ribosomes libres et ribosomes li\u00e9s \u00e0 la membrane ; il n\u2019y a qu\u2019une seule population de ribosomes Quels sont les fonctions respectives des ribosomes des deux pools ? Comment se fait le choix entre la synth\u00e8se prot\u00e9ique par les ribosomes li\u00e9s plut\u00f4t que par les ribosomes cytosoliques ? Comment un polypeptide dont la s\u00e9quence primaire comporte majoritairement des acides amin\u00e9s hydrophiles traverse-t-il la bicouche phospholipidique hydrophobe de la membrane ?<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Blobel G Sabatini DD Controlled proteolysis of nascent polypeptides in rat liver cell fractions. I. Location of the polypeptides within ribosomes<\/i> (1970)
\nSabatini DD Blobel G Controlled proteolysis of nascent polypeptides in rat liver cell fractions. II. Location of the polypeptides in rough microsomes<\/i> (1970)<\/span><\/p>\n

Dans un article publi\u00e9 en 1971 dans le volume 2 de la s\u00e9rie Biomembranes<\/i>, \u00e9dit\u00e9e par Lionel A. Manson, Blobel et Sabatini formul\u00e8rent l\u2019hypoth\u00e8se que le choix du ribosome est dict\u00e9 par une s\u00e9quence de codons pr\u00e9sente \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 5\u2019 des ARNm traduits par le reticulum endoplasmique rugueux, mais absente chez les ARNm traduits par les ribosomes libres. Les modalit\u00e9s de cette premi\u00e8re version de l\u2019hypoth\u00e8se du signal (Signal Hypothesis<\/i>) furent compl\u00e9t\u00e9es par Blobel, en 1975 et dans les ann\u00e9es suivantes, : \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 N-terminale des prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires, un peptide d\u2019une trentaine d\u2019acides amin\u00e9s, essentiellement hydrophobes, se fixe \u00e0 la membrane du reticulum endoplasmique. Ce peptide \u00e9mergeant de la grosse sous-unit\u00e9 ribosomiale, est reconnu par un r\u00e9cepteur qui dirige l\u2019ensemble vers la membrane L\u2019existence du peptide signal est transitoire ; il est retir\u00e9 au cours de la d\u00e9charge vectorielle du polypeptide naissant.<\/p>\n

Il existe une grande diversit\u00e9 de tailles et de compositions parmi les s\u00e9quences signal N-terminales ; elles comportent en moyenne 15 \u00e0 25 r\u00e9sidus d\u2019acides amin\u00e9s, parfois jusqu\u2019\u00e0 50 ou plus. Elles comportent une r\u00e9gion riche en acides amin\u00e9s hydrophobes (leucine, isoleucine, alanine, ph\u00e9nylalanine, valine, tryptophane, tyrosine), encadr\u00e9e par une r\u00e9gion amino-terminale et une r\u00e9gion carboxy-terminale contenant le site de clivage de la peptidase du signal.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Blobel G, Sabatini DD Ribosome-Membrane Interaction in Eukaryotic Cells<\/i> (1971)
\nBlobel G, Dobberstein B Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma<\/i> (1975)
\nBlobel G, Walter P, Chang CN, Goldman BM, Erikson AH, Lingappa VR Proteolytic Processing of Signal Peptides<\/i> (1979)
\nBlobel G Intracellular protein topogenesis<\/i> (1980) <\/span><\/p>\n

Le bien fond\u00e9 de l\u2019hypoth\u00e8se du signal re\u00e7ut une premi\u00e8re confirmation avec la publication, en 1972, de l\u2019article de Cesar Milstein (Department of Biochemistry, Cambridge University<\/i>) \u2013 l\u2019inventeur avec Georges K\u00f6hler des anticorps monoclonaux. Il rapporta que la cha\u00eene l\u00e9g\u00e8re d\u2019immunoglobuline IgG synth\u00e9tis\u00e9e in vitro<\/i> dans un syst\u00e8me acellulaire \u00e9tait plus longue que la cha\u00eene \u00ab normale \u00bb; la diff\u00e9rence de taille correspondait \u00e0 un peptide de 2,3 kilodaltons. En pr\u00e9sence de microsomes ajout\u00e9s au syst\u00e8me acellulaire la prot\u00e9ine synth\u00e9tis\u00e9e avait la taille normale. Milstein formula l\u2019hypoth\u00e8se que l\u2019immunoglobuline \u00e9tait synth\u00e9tis\u00e9e sous forme d\u2019un pr\u00e9curseur plus long que la cha\u00eene l\u00e9g\u00e8re et qu\u2019avant d\u2019\u00eatre s\u00e9cr\u00e9t\u00e9e par le plasmocyte, la s\u00e9quence additionnelle \u00e9tait excis\u00e9e par une peptidase pr\u00e9sente dans les microsomes. Les r\u00e9sultats de Milstein, et leur interpr\u00e9tation suscit\u00e8rent d\u2019abord le doute : le peptide additionnel \u00e9tait un artefact des syst\u00e8mes acellulaires de synth\u00e8se prot\u00e9ique (lysat de r\u00e9ticulocytes de lapin, extrait de germes de bl\u00e9). Ils furent rapidement confirm\u00e9s par les r\u00e9sultats du g\u00e9n\u00e9ticien Philip Leder (Laboratory for Molecular Genetics, National Institute of Health, Bethesda<\/i>), de Susumi Tonegawa et Maria Irene Baldi (Basel Institute for Immunology<\/i>) et d\u2019Israel Schechter. D\u2019autres donn\u00e9es, de nature g\u00e9n\u00e9tique, vinrent \u00e0 l\u2019appui de l\u2019hypoth\u00e8se du signal. L\u2019invertase, un enzyme de la muqueuse intestinale qui catalyse l\u2019hydrolyse du saccharose, existe sous deux isoformes : une forme cytoplasmique et une forme s\u00e9cr\u00e9t\u00e9e. Les deux ont la m\u00eame s\u00e9quence primaire, mais le g\u00e8ne codant pour la forme s\u00e9cr\u00e9t\u00e9e poss\u00e8de un exon suppl\u00e9mentaire sp\u00e9cifiant un peptide amino-terminal. L’immunoglobuline M poss\u00e8de une isoforme membranaire et une isoforme s\u00e9cr\u00e9t\u00e9e portant un peptide signal amino-terminal. Le g\u00e8ne codant l\u2019isoforme membranaire poss\u00e8de une s\u00e9quence codant un peptide signal et un exon suppl\u00e9mentaire sp\u00e9cifiant la s\u00e9quence hydrophobe d\u2019un peptide transmembranaire \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 carboxy-terminale de l’immunoglobuline M.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Milstein C, Brownlee GG, Harrison TM, Mathews MB A Possible Precursor of Immunoglobulin Light Chains<\/i> (1972)
\nTonegawa S, Baldi I Electrophoretically Homogeneous Myeloma Light Chain mRNA and its Transcription in vitro<\/i> (1973)
\nSchechter I, Burstein Y Marked hydrophobicity of the NH2-terminal extra piece of immunoglobulin light-chain precursors: possible physiological functions of the extra piece<\/i> (1976)<\/span><\/p>\n

Pour poursuivre l\u2019\u00e9tude du mode d\u2019accostage des ribosomes sur la membrane du reticulum endoplasmique, et de la translocation co-traductionnelle du polypeptide n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9, il fallait mettre au point un syst\u00e8me acellulaire combinant synth\u00e8se prot\u00e9ique et translocation. Pour le syst\u00e8me de synth\u00e8se prot\u00e9ique in vitro<\/i>, on eut recours \u00e0 un lysat de r\u00e9ticulocytes de lapin programm\u00e9 par de l\u2019ARNm de my\u00e9lome de la souris : le produit de traduction est plus long que la cha\u00eene l\u00e9g\u00e8re d\u2019immunoglobuline s\u00e9cr\u00e9t\u00e9e. La mise au point d\u2019un syst\u00e8me de translocation co-traductionnelle du polypeptide naissant fut plus laborieuse ; l\u2019addition de microsomes au milieu de traduction inhibait la synth\u00e8se prot\u00e9ique. Gunter Blobel et Bernhard Dobberstein (The Rockefeller University, New York<\/i>) d\u00e9couvrirent, apr\u00e8s de longs t\u00e2tonnements, que les microsomes de pancr\u00e9as de chien n\u2019exercent pas cet effet inhibiteur sur un syst\u00e8me de synth\u00e8se prot\u00e9ique in vitro<\/i> programm\u00e9 par de l\u2019ARNm de cha\u00eene l\u00e9g\u00e8re d\u2019IG. En pr\u00e9sence de microsomes, le produit de synth\u00e8se avait la taille de l\u2019immunoglobuline s\u00e9cr\u00e9t\u00e9e ; il \u00e9tait d\u00e9charg\u00e9 \u00e0 l\u2019int\u00e9rieur des v\u00e9sicules, comme le montrait son inaccessibilit\u00e9 aux prot\u00e9ases ajout\u00e9es dans le milieu. La diff\u00e9rence de taille entre les immunoglobulines synth\u00e9tis\u00e9es en absence ou en pr\u00e9sence de microsomes correspondait \u00e0 un peptide d\u2019une vingtaine d\u2019acides amin\u00e9s \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale. Les r\u00e9sultats du s\u00e9quen\u00e7age indiqu\u00e8rent que la partie centrale du peptide \u00e9tait majoritairement constitu\u00e9e d\u2019acides amin\u00e9s hydrophobes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Blobel G, Dobberstein B Transfer of proteins across membranes. II. Reconstitution of functional rough microsomes from heterologous components<\/i> (1975)<\/span><\/p>\n

Dans leur publication de 1971, Sabatini et Blobel avaient accompagn\u00e9 l\u2019expos\u00e9 de leur hypoth\u00e8se par une illustration montrant la reconnaissance par un \u00ab facteur \u00bb de la s\u00e9quence amino-terminale du polypeptide n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9 et toujours li\u00e9 au ribosome : \u00ab This binding factor could be a soluble protein<\/i> \u00bb ; il fut isol\u00e9 \u00e0 la fin des ann\u00e9es 1970. Dans un syst\u00e8me in vitro<\/i> couplant synth\u00e8se prot\u00e9ique et d\u00e9charge co-traductionnelle du polypeptide, la capacit\u00e9 de translocation des microsomes est abolie par deux types de traitement: le lavage par une solution saline ou par une attaque prot\u00e9olytique. En 1978, Graham Warren et Bernhard Dobberstein (European Molecular Biology Laboratory<\/i>) montr\u00e8rent que la capacit\u00e9 de translocation de microsomes lav\u00e9s peut \u00eatre restor\u00e9e par un facteur pr\u00e9sent dans l’extrait salin ; il fut identifi\u00e9 en 1980 par Peter Walter et G\u00fcnter Blobel (The Rockefeller Institute<\/i>) et baptis\u00e9 \u00ab Particule de reconnaissance du signal \u00bb (Signal Recognition Particle, SRP<\/i>) en 1981. Chez les eucaryotes, cette machine mol\u00e9culaire de forme allong\u00e9e contient 6 polypeptides (72, 68, 54, 19, 14 et 9 kDa) avec un site de fixation du GTP, et un ARN de 300 nucl\u00e9otides (coefficient de s\u00e9dimentation 7S<\/i>). La SRP<\/i> est abondante dans le cytoplasme et son importance physiologique est attest\u00e9e par le degr\u00e9 de conservation \u00e9lev\u00e9 de l\u2019ARN 7S<\/i>, des Arch\u00e9obact\u00e9ries \u00e0 l\u2019homme. Ce petit acide ribonucl\u00e9ique contient en effet une information essentielle au fonctionnement de la ribonucl\u00e9oprot\u00e9ine. Chez les bact\u00e9ries, d\u00e9pourvues de reticulum endoplasmique, la particule se compose d\u2019un ARN 4,5S<\/i> et d\u2019une prot\u00e9ine homologue de la prot\u00e9ine de 54 kDa. Peter Walter montra que le r\u00f4le de la SRP<\/i> est de reconna\u00eetre le peptide signal d\u00e8s qu\u2019il \u00e9merge de la grosse sous-unit\u00e9 ribosomiale. Le peptide en cours de synth\u00e8se est alors form\u00e9 d\u2019environ 70 r\u00e9sidus d\u2019acides amin\u00e9s, dont 40 sont s\u00e9questr\u00e9s dans le ribosome. Ajout\u00e9 \u00e0 un syst\u00e8me de synth\u00e8se prot\u00e9ique \u00e0 base de germe de bl\u00e9, programm\u00e9 par un ARNm, l\u2019addition de SRP<\/i> ralentit significativement la vitesse d\u2019\u00e9longation d\u2019un peptide s\u00e9cr\u00e9toire mais pas de prot\u00e9ines cytosoliques, comme les cha\u00eenes \u03b1 et \u03b2 de la globine. L\u2019inhibition est lev\u00e9e par addition de microsomes lav\u00e9s par une solution saline mais n\u2019est pas lev\u00e9e par des microsomes ayant subi une attaque prot\u00e9olytique. On a montr\u00e9 que la SRP<\/i> ralentit la vitesse d\u2019\u00e9longation d\u2019un peptide en cours de synth\u00e8se en bloquant le site ribosomial de fixation des facteurs d\u2019\u00e9longation eF1 et eF2.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Warren G, Dobberstein B Protein transfer across microsomal membranes reassembled from separated membrane components<\/i> (1978)
\nWalter P, Blobel G Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum II, Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membrane of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory proteins<\/i> (1981)
\nWalter P, Blobel G Disassembly and reconstitution of signal recognition particle<\/i> (1983)<\/span><\/p>\n

La poursuite de l\u2019\u00e9longation impliquait la lev\u00e9e du blocage par un facteur que l\u2019on supposait associ\u00e9 au reticulum endoplasmique ; il fut isol\u00e9 en 1982 par David Meyer et Bernhard Dobberstein (European Molecular Biology Laboratory<\/i>) par prot\u00e9olyse m\u00e9nag\u00e9e de microsomes rugueux en pr\u00e9sence d\u2019une concentration saline \u00e9lev\u00e9e. C\u2019est un h\u00e9t\u00e9rodim\u00e8re constitu\u00e9 d\u2019une sous-unit\u00e9 \u03b1, \u00e0 la face cytosolique du reticulum, et d\u2019une sous-unit\u00e9 \u03b2 ins\u00e9r\u00e9e dans la membrane. La sous-unit\u00e9 \u03b1 est une GTPase. Le mode d\u2019interaction entre les facteurs de l\u2019extrait prot\u00e9olytique et de l\u2019extrait salin fut \u00e9lucid\u00e9 par Reid Gilmore et G\u00fcnter Blobel (The Rockefeller University<\/i>). Le premier, baptis\u00e9 docking protein<\/i>, est le r\u00e9cepteur de la SRP<\/i>. L\u2019interaction SRP \u2013 r\u00e9cepteur de la SRP<\/i> permet l\u2019accostage s\u00e9lectif sur le reticulum endoplasmique du complexe ribosome \u2013 peptide signal \u2013 SRP<\/i>. C\u2019est l\u2019\u00e9tape cruciale de la translocation co-traductionnelle des prot\u00e9ines \u00e0 travers la membrane ; elle est sous la d\u00e9pendance de l\u2019hydrolyse de mol\u00e9cules de GTP li\u00e9es \u00e0 la sous-unit\u00e9 \u03b1 du r\u00e9cepteur et \u00e0 la SRP<\/i>:<\/p>\n

GTP → GDP + Pi<\/p>\n

L\u2019hydrolyse de GTP provoque un changement de conformation qui entra\u00eene le d\u00e9tachement de la SRP<\/i> du peptide signal et du ribosome. La s\u00e9quence signal traverse la membrane ce qui la met \u00e0 l\u2019abri d\u2019une attaque par des prot\u00e9ases cytosoliques. Le blocage de l\u2019\u00e9longation cesse et la synth\u00e8se du polypeptide reprend sur le ribosome li\u00e9 \u00e0 la membrane.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Meyer DI, Dobberstein B Identification and characterization of a membrane component essential for the translocation of nascent proteins across the membrane of the endoplasmic reticulum<\/i> (1980)
\nMeyer DI, Dobberstein B A membrane component essential for vectorial translocation of nascent proteins across the membrane of the endoplasmic reticulum: requirements for its extraction and reassociation with the membrane <\/i> (1980)
\nWalter P, Blobel G Purification of a membrane-associated protein complex required for protein translocation across the endoplasmic reticulum<\/i> (1980)
\nGilmore R, Blobel G, Walter P Protein translocation across the endoplasmic reticulum. I. Detection in the microsomal membrane of a receptor for the signal recognition particle<\/i> (1982)
\nGilmore R, Walter P, Blobel G Protein translocation across the endoplasmic reticulum. II. Isolation and characterization of the signal recognition particle receptor<\/i> (1982)
\nMeyer DI, Krause E, Dobberstein B Secretory protein translocation across membranes-the role of the \u201cdocking protein\u201d <\/i> (1982)<\/span><\/p>\n

G\u00fcnter Blobel et R. C. Jackson ont solubilis\u00e9 la peptidase du signal de pancr\u00e9as de chien, en traitant les microsomes rugueux avec du d\u00e9soxycholate de sodium. En incubant cet extrait avec les pr\u00e9curseurs de la prolactine et de l\u2019hormone de croissance, synth\u00e9tis\u00e9s dans un extrait de germe de bl\u00e9, la taille des pr\u00e9curseurs est r\u00e9duite \u00e0 celle des hormones matures. Dans un test post-traductionnel, Jackson mit en contact l\u2019extrait avec le pr\u00e9curseur de la prolactine ; le produit d\u2019incubation a la m\u00eame taille que l\u2019hormone mature et les r\u00e9sultats d\u2019un s\u00e9quen\u00e7age partiel indiquent que l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale est la m\u00eame que celle de l\u2019hormone. Les microsomes rugueux sont inactifs sur le pr\u00e9curseur. La peptidase du signal est localis\u00e9e \u00e0 l\u2019int\u00e9rieur des v\u00e9sicules, c\u2019est-\u00e0-dire dans le lumen du reticulum endoplasmique. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Jackson RC, Blobel G Post-translational processing of full-length presecretory proteins with canine pancreatic signal peptidase<\/i> (1980)
\nEvans EA, Gilmore R, Blobel G Purification of microsomal signal peptidase as a complex<\/i> (1986) <\/span><\/p>\n

Le complexe de la peptidase du signal a \u00e9t\u00e9 purifi\u00e9 \u00e0 partir de microsomes de pancr\u00e9as de chien par Emily A. Evans et Reid Gilmore dans le laboratoire de G\u00fcnter Blobel. Le r\u00e9sultat de l\u2019analyse par \u00e9lectrophor\u00e8se sur gel de polyacrylamide r\u00e9v\u00e8le qu\u2019il est constitu\u00e9 de six polypeptides (quatre chez la levure) de masses mol\u00e9culaires 25, 23, 22, 21, 18, and 12 kDa, dont certains sont glycosyl\u00e9s (23 et 22 kDa). L\u2019ensemble est int\u00e9gr\u00e9 dans la membrane du reticulum endoplasmique. Un seul polypeptide, ins\u00e9r\u00e9 dans la membrane par son extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale et dont l\u2019essentiel \u00e9merge dans le lumen, porte le site actif (endopeptidase) ; il clive le peptide signal d\u00e8s son \u00e9mergence du translocon. La peptidase du signal (leader peptidase<\/i>) existe aussi chez les bact\u00e9ries ; celle d\u2019Escherichia coli<\/i> a \u00e9t\u00e9 caract\u00e9ris\u00e9e par C. Zwinsinski et William Wickner (Department of Biological Chemistry, University of California, Los Angeles<\/i>). Il existe deux peptidases du signal : la peptidase I, dont le g\u00e8ne lep a \u00e9t\u00e9 s\u00e9quenc\u00e9 par Paul B. Wolfes et coll., et la peptidase II cod\u00e9e par le g\u00e8ne lsp. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Zwinsinski C, Wickner W Purification and characterization of leader (signal) peptidase from Escherichia coli<\/i> (1980)
\nWolfe PB, Wickner W, Goodman JM <\/i>Sequence of the Leader Peptidase Gene of Escherichia coli and the Orientation of Leader Peptidase in the Bacterial Envelope<\/i> (1983) <\/span><\/p>\n

Domenica Borghese, dans le laboratoire de David D. Sabatini (Department of Cell Biology New York University School of Medicine<\/i>), a montr\u00e9 que l\u2019on peut fixer des ribosomes in vitro<\/i>, en l\u2019absence de synth\u00e8se prot\u00e9ique, sur des microsomes rugueux, pr\u00e9alablement d\u00e9granul\u00e9s. Les sites sp\u00e9cifiques fixant les ribosomes ne sont pas pr\u00e9sents dans la membrane des microsomes lisses ou celle des globules rouges. Les sites de fixation des ribosomes in vitro<\/i> ont des constantes apparentes d\u2019affinit\u00e9 \u00e9lev\u00e9es : elles ont \u00e9t\u00e9 mesur\u00e9es avec en incubant des 3<\/sup>H-ribosomes 80 S<\/i>, pr\u00e9par\u00e9s \u00e0 partir de cellules (cellules h\u00e9matopo\u00ef\u00e9tiques HPC, cellules du my\u00e9lome 456) cultiv\u00e9es en pr\u00e9sence de 3<\/sup>H-uridine, avec des v\u00e9sicules rugueuses dont les ribosomes ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9tach\u00e9s par traitement avec des ch\u00e9lateurs dans un milieu de force ionique \u00e9lev\u00e9e (KCl 700 mM). <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Borghese D, Mok W, Kreibich G, Sabatini DD Ribosomal-membrane interaction: in vitro binding of ribosomes to microsomal membranes<\/i> (1974)
\nDavis JL, Morris RO The affinity of rat liver ribosome subunits for degranulated rough microsomal membranes<\/i> (1976) <\/span><\/p>\n

Le traitement de microsomes rugueux de foie de rat par le d\u00e9tergent non-ionique Kyro EOB \u00e9limine la majorit\u00e9 des prot\u00e9ines pr\u00e9sentes dans la pr\u00e9paration ; deux prot\u00e9ines restent attach\u00e9es aux polysomes li\u00e9s \u00e0 la membrane. Elles sont fusionn\u00e9es aux polysomes apr\u00e8s traitement de microsomes rugueux par un agent liant. Elles se d\u00e9placent lat\u00e9ralement en m\u00eame temps que les ribosomes, et se retrouvent avec eux dans des \u00ab v\u00e9sicules invers\u00e9es \u00bb, obtenues en traitant des microsomes rugueux par du Triton-X-100 \u00e0 faible concentration. <\/p>\n

Ces deux glycoprot\u00e9ines transmembranaires sont pr\u00e9sentes dans les microsomes rugueux de tissus s\u00e9cr\u00e9toires de plusieurs esp\u00e8ces animales. Croyant avoir affaire aux sites de fixation des ribosomes sur la membrane du reticulum endoplasmique, Gert Kriebich et coll. les ont baptis\u00e9es: ribophorine I (MW 65,000) et ribophorine II (MW 63,000). Leur v\u00e9ritable fonction fut d\u00e9couverte lorsqu\u2019on a isol\u00e9 le complexe de l\u2019oligosaccharyl-transf\u00e9rase, et \u00e9tabli sa composition en polypeptides. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Kreibich G, Czako-Graham M, Grebenau W, Mok W, Rodriguez-Boulan E, Sabatini DD Characterization of the ribosomal binding sites in rat liver rough microsomes: ribophorins I and II, two integral membrane proteins to ribosome binding<\/i> (1978)
\nKreibich G, Freienstein B, Pereyra BN, Ulrich BL, Sabatini DD Proteins of rough microsomal membranes related to ribosome binding. II. Crosslinking of bound ribosomes to specific membrane proteins exposed at the binding sites<\/i> (1978)
\nKreibich G, Ojakian G, Rodriguez-Boulan E, Sabatini DD Recovery of ribophorins and ribosomes in \u201cinverted rough\u201d vesicles derived from rat liver rough microsomes<\/i> (1982)
\nAmar-Costesec A, Todd JA, Kreibich G Segregation of the Polypeptide Translocation Apparatus to Regions of the Endoplasmic Reticulum Containing Ribophorins and Ribosomes. I. Functional Tests in Rat Liver Microsomal Subfractions<\/i> (1984) <\/span><\/p>\n

William J. Lennarz et coll (Department of Physiological Chemistry, The John Hopkins University School of Medicine, Baltimore<\/i>) ont montr\u00e9 que la glycosylation des prot\u00e9ines par la voie des interm\u00e9diaires lipidiques est localis\u00e9e dans les microsomes rugueux d\u2019oviducte de poulet et pas dans les microsomes lisses. Une partie des r\u00e9actions de cette voie sont sensibles \u00e0 une digestion prot\u00e9olytique des v\u00e9sicules : ces r\u00e9actions se d\u00e9roulent sur la face cytoplasmique de la membrane du reticulum endoplasmique, tandis que le transfert de l\u2019oligosaccharide su le polypeptide, insensible aux prot\u00e9ases, a lieu sur la face luminale. Lennarz et coll. ont propos\u00e9 un mod\u00e8le regroupant l\u2019ensemble de ces r\u00e9actions en un complexe multienzymatique transmembranaire. Les donn\u00e9es r\u00e9centes sur l\u2019oligosaccharyl-transf\u00e9rase ont confirm\u00e9 la validit\u00e9 de ce mod\u00e8le : avant son transfert sur le polypeptide en cours de synth\u00e8se, la cha\u00eene glycanique est port\u00e9e par un lipide membranaire, le dolichol pyrophosphate, localis\u00e9 sur la face cytoplasmique de la membrane. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Czichi U, Lennarz WJ Localization of the enzyme system for glycosylation of proteins via the lipid-linked pathway in rough endoplasmic reticulum<\/i> (1977)
\nHannover JA, Lennarz WJ N-Linked glycoprotein assembly. Evidence that oligosaccharide attachment occurs within the lumen of the endoplasmic reticulum<\/i> (1980)
\nHanover JA, Lennarz WJ Transmembrane Assembly of N-linked Glycoproteins. Studies on the topology of saccharide-lipid synthesis<\/i> (1982) <\/span><\/p>\n

La dolichyl diphospho-oligosaccharyl-transf\u00e9rase est le complexe enzymatique responsable de la N-glycosylation co-traductionnelle des polypeptides synth\u00e9tis\u00e9s par les ribosomes li\u00e9s \u00e0 la membrane du reticulum endoplasmique. Elle a \u00e9t\u00e9 caract\u00e9ris\u00e9e pour la premi\u00e8re fois \u00e0 partir de pancr\u00e9as de chien,en 1992, dans le laboratoire de Reid Gilmore (University of Massachusetts Medical School<\/i>). Le complexe est form\u00e9 de quatre de 4 sous-unit\u00e9s membranaires : ribophorines I et II, OST48 (oligosaccharyl-transf\u00e9rase de 48 kDa), et DAD-l (Defender against Apoptotic cell Death 1<\/i>). Les quatre sous-unit\u00e9s seraient impliqu\u00e9es dans le transfert, et le segment transmembranaire de la ribophorine I, dans la reconnaissance du dolichol.L\u2019oligosaccharyl-transf\u00e9rase est localis\u00e9e sur la face luminale de la membrane. Elle intervient imm\u00e9diatement apr\u00e8s l\u2019excision du peptide amino-terminal par la peptidase du signal, en transf\u00e9rant d\u2019une cha\u00eene glycanique sur un r\u00e9sidu asparagine du polypeptide en cours de synth\u00e8se. Comme l\u2019enl\u00e8vement du peptide signal, la N-glycosylation est co-traductionnelle. Dans les cellules eucaryotes, l\u2019oligosaccharyl-transf\u00e9rase catalyse le transfert du glycan : <\/p>\n

Glc3-Man9-GlcNAc2<\/center><\/b><\/p>\n

du dolichol-pyrophosphate sur un r\u00e9sidu asparagine, au sein du triplet Asn-X-Ser\/Thr des cha\u00eenes polypeptidiques naissantes. En \u00e9tudiant le transfert de l\u2019oligosaccharide sur des prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires d\u00e9natur\u00e9es – ovalbumine, \u03b1-lactalbumine, ribonucl\u00e9ase A – William J. Lennarz et coll. (Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University, New York<\/i>) avaient montr\u00e9, en 1977, que la pr\u00e9sence de la s\u00e9quence consensus Asn-X-(Ser\/Thr) est n\u00e9cessaire mais pas suffisante ; pour qu\u2019un polypeptide soit accepteur d\u2019un oligosaccharide, il doit \u00eatre en conformation d\u00e9pli\u00e9e, sans structures secondaires, comme cela a \u00e9t\u00e9 montr\u00e9 montr\u00e9 en mettant en contact une pr\u00e9paration membranaire d\u2019oviducte de poulet avec les prot\u00e9ines d\u00e9natur\u00e9es. C\u2019est pr\u00e9cis\u00e9ment dans cette conformation que se trouve le polypeptide en cours d\u2019\u00e9longation ; il traverse la membrane par un canal hydrophile, \u00e9merge dans le lumen o\u00f9 a lieu le transfert de l\u2019oligosaccharide. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Pless DD, Lennarz WJ Enzymatic conversion of proteins to glycoproteins<\/i> (1977)
\nKronquist KE, Lennarz WJ Enzymatic conversion of proteins to glycoproteins by lipid-linked saccharides: a study of potential exogenous acceptor proteins<\/i> (1978)
\nPirozzi G Rat ribophorin II: molecular cloning and chromosomal localization of a highly conserved transmembrane glycoprotein of the rough endoplasmic reticulum<\/i> (1991)
\nKelleher J, Kreibich G, Gilmore R Oligosaccharyltransferase activity is associated with a protein complex composed of ribophorins I and II and a 48 kd protein<\/i> (1992)
\nFu J, Pirozzi G, Sanjay A, Levy R, Chen Y, De Lemos-Chiarandini C, Sabatini C, Kreibich G Localization of ribophorin II to the endoplasmic reticulum involves both its transmembrane and cytoplasmic domains<\/i> (2000) <\/span><\/p>\n

La d\u00e9charge vectorielle des polypeptides en cours de synth\u00e8se se fait par un canal traversant la membrane du reticulum endoplasmique rugueux. Ce canal pourrait \u00eatre en continuit\u00e9 avec celui qui traverse la grosse sous-unit\u00e9 ribosomiale, observ\u00e9 pour la premi\u00e8re fois par David Sabatini au microscope \u00e9lectronique, apr\u00e8s coloration n\u00e9gative de v\u00e9sicules microsomales de foie de cobaye. La n\u00e9cessit\u00e9 d\u2019un canal transmembranaire fut l\u2019objet de d\u00e9bats. Certains polypeptides ont la capacit\u00e9 de traverser la bicouche phospholipidique en l\u2019absence de liaison du ribosome \u00e0 la membrane et sans passer par un canal. Mike Mueckler et Harvey F. Lodish ont synth\u00e9tis\u00e9 dans un extrait de germe de bl\u00e9, et en pr\u00e9sence de microsomes de pancr\u00e9as, le transporteur du glucose (Human Glucose Transporter<\/i>) et les fragments correspondant aux extr\u00e9mit\u00e9s amino-terminale (340 r\u00e9sidus d\u2019acides amin\u00e9s) et carboxy-terminale (148 acides amin\u00e9s). Ils ont observ\u00e9 l\u2019insertion post-traductionnelle et l\u2019int\u00e9riorisation dans les microsomes du transporteur du glucose et du fragment amino-terminal, comme en t\u00e9moigne la r\u00e9sistance \u00e0 l\u2019endoglycosidase H ou la trypsine.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Mueckler M, Lodish HF The human glucose transporter can insert posttranslationally into microsomes<\/i> (1986)<\/p>\n

Le canal, s\u2019il existe, doit avoir un certain nombre de caract\u00e9ristiques et de propri\u00e9t\u00e9s : il doit \u00eatre constitu\u00e9 de prot\u00e9ines transmembranaires ; il doit permettre le passage des portions hydrophiles des polypeptides et les prot\u00e9ines luminales ou s\u00e9cr\u00e9toires solubles, ainsi que le passage des portions hydrophobes des prot\u00e9ines int\u00e9grales mono- ou poly-topiques ; en l\u2019absence de synth\u00e8se prot\u00e9ique, le canal doit \u00eatre ferm\u00e9 pour emp\u00eacher le passage dans le lumen de micro mol\u00e9cules et d\u2019ions. Il doit s\u2019ouvrir lors de l\u2019accostage du ribosome sur la membrane pour permettre la d\u00e9charge co-traductionnelle vectorielle des peptides. En 1985, Gilmore et Blobel ont montr\u00e9 qu\u2019un canal hydrophile form\u00e9 de prot\u00e9ines membranaires int\u00e9grales est impliqu\u00e9 dans la translocation d\u2019un polypeptide \u00e0 travers la membrane microsomiale. Dans un syst\u00e8me acellulaire de synth\u00e8se prot\u00e9ique et en pr\u00e9sence de v\u00e9sicules microsomiales, ils ont arr\u00eat\u00e9 la d\u00e9charge vectorielle d\u2019un polypeptide \u00e0 deux \u00e9tapes de l\u2019\u00e9longation : lorsqu\u2019il avait une taille de \u223c70 r\u00e9sidus (blocage par la particule de reconnaissance du signal) ou de \u223c158 r\u00e9sidus (blocage par un oligonucl\u00e9otide). Dans les deux cas, les polypeptides restaient li\u00e9s \u00e0 la membrane apr\u00e8s d\u00e9tachement du ribosome ; ils \u00e9taient extrait par traitement avec un agent d\u00e9naturant soluble en milieu aqueux (ur\u00e9e 4M). Le transfert de la cha\u00eene peptidique \u00e0 travers la membrane se fait donc dans un microenvironnement hydrophile. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Gilmore R, Blobel G Translocation of secretory proteins across the microsomal membrane occurs through an environment accessible to aqueous perturbants<\/i> (1985)<\/span><\/p>\n

En 1989, l\u2019existence d\u2019un canal traversant la membrane du reticulum endoplasmique fut mise en \u00e9vidence \u00e0 la suite d\u2019\u00e9l\u00e9gantes exp\u00e9riences d\u2019\u00e9lectrophysiologie de Sanford Simon, G\u00fcnter Blobel et Joshua Zimmerberg. Les mesures de conductance \u00e9lectrique de la membrane de microsomes rugueux de pancr\u00e9as de chien, soumise \u00e0 des diff\u00e9rences de potentiel, r\u00e9v\u00e8lent l\u2019existence de canaux ouverts lorsque le potentiel est n\u00e9gatif sur la face cytoplasmique de la membrane ; leur nombre augmente significativement apr\u00e8s addition de GTP. Par contre les canaux sont ferm\u00e9s en pr\u00e9sence d\u2019ATP ou de guanosine 5′-[\u03b3-thio] triphosphate, un analogue du GTP. Ces canaux pourraient permettre le transfert co-traductionnel des polypeptides n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9s.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Simon SM, Blobel G, Zimmerberg J Large aqueous channels in membrane vesicles derived from the rough endoplasmic reticulum of canine pancreas or the plasma membrane of Escherichia coli<\/i> (1989)<\/span><\/p>\n

Les r\u00e9sultats des exp\u00e9riences rapport\u00e9es ci-dessus sugg\u00e8rent l\u2019existence de canaux transmembranaires (Protein-Conducting Channel<\/i>) fonctionnels (ouverts) ou non-fonctionnels (ferm\u00e9s). Pour \u00e9lucider le m\u00e9canisme du cycle d\u2019ouverture et de fermeture, Sanford Simon et G\u00fcnter Blobel ont utilis\u00e9s les techniques d\u2019\u00e9lectrophysiologie sur des microsomes rugueux de pancr\u00e9as. Deux compartiments aqueux contenant une solution saline \u00e9taient s\u00e9par\u00e9s par une membrane constitu\u00e9e d\u2019une bicouche phospholipidique. La face cytoplasmique des v\u00e9sicules microsomiales \u00e9tait fusionn\u00e9e \u00e0 la face cis de la bicouche. L\u2019addition de puromycine \u00e0 forte concentration (100 \u03bcM) du c\u00f4t\u00e9 cis provoque une nette augmentation de la conductance ; l\u2019antibiotique d\u00e9tache les polypeptides traversant le canal ; l\u2019addition de puromycine \u00e0 faible concentration (0,33 \u03bcM) ouvre des canaux individuels. L\u2019augmentation de la concentration saline (de 150 \u00e0 400 mM) du c\u00f4t\u00e9 cis provoque la lib\u00e9ration des ribosomes li\u00e9 \u00e0 la membrane et la fermeture des canaux. L\u2019ouverture des canaux est d\u00e9clench\u00e9e par l\u2019accostage du ribosome sur la membrane du reticulum endoplasmique. Kathleen S. Crowley et coll. (Department of Chemistry and Biochemistry University of Oklahoma Norman<\/i>) ont incorpor\u00e9 des sondes fluorescentes dans le peptique signal d\u2019une prot\u00e9ine s\u00e9cr\u00e9toire. L\u2019extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale de la prot\u00e9ine naissante se trouve dans un environnement aqueux dans le tunnel traversant la ribosome, et durant les premi\u00e8res \u00e9tapes de la translocation \u00e0 travers la membrane du reticulum endoplasmique. G\u00fcnter Blobel a re\u00e7u le prix Nobel de m\u00e9decine ou physiologie 1999.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Simon SM, Blobel G A protein-conducting channel in the endoplasmic reticulum<\/i> (1991)
\nCrowley KS, Reinhart GD, Johnson AE The signal sequence moves through a ribosomal tunnel into a noncytoplasmic aqueous environment at the ER membrane early in translocation<\/i> (1993) <\/span><\/p>\n

On a \u00e9tabli la structure cristallographique du translocon Sec de plusieurs esp\u00e8ces, en particulier celle du translocon simplifi\u00e9 des Arch\u00e9es (Methanococcus jannaschii<\/i>). Chez les eucaryotes pluricellulaires, c\u2019est un h\u00e9t\u00e9rotrim\u00e8re Sec61\u03b1, Sec61\u03b2 et Sec61\u03b3 ; les sous-unit\u00e9s \u03b1, \u03b2 et \u03b3 sont tr\u00e8s conserv\u00e9es, y compris chez la levure, les bact\u00e9ries et les Arch\u00e9es ; la contribution des trois sous-unit\u00e9s est n\u00e9cessaire au fonctionnement du pore. Apr\u00e8s l\u2019accostage du ribosome sur le r\u00e9cepteur de la SRP, l\u2019interaction de ce r\u00e9cepteur avec Sec61 d\u00e9clenche le transfert du complexe ribonucl\u00e9oprot\u00e9ique sur le translocon. La reprise de l\u2019\u00e9longation du peptide force le clapet fermant le pore. Le transfert est vectoriel (l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 N-terminale en premier) et unidirectionnel, du cytosol vers la lumi\u00e8re du reticulum. Le peptide signal \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale \u00e9merge le premier dans le lumen o\u00f9 il est excis\u00e9 par la peptidase du signal. Lorsque la translocation du polypeptide, totale (prot\u00e9ines solubles) ou partielle (prot\u00e9ines membranaires), est achev\u00e9e, le ribosome se d\u00e9tache du translocon et se dissocie en sous-unit\u00e9s.<\/p>\n

Le translocon Sec de la membrane cytoplasmique des bact\u00e9ries est responsable de la s\u00e9cr\u00e9tion des prot\u00e9ines et de l\u2019insertion des prot\u00e9ines membranaires ; il est constitu\u00e9 du complexe SecYEG et de deux prot\u00e9ines associ\u00e9es, dont l\u2019insertase YidC. Il a fait l\u2019objet d\u2019\u00e9tudes de biologie ultrastructurale par un groupe de chercheurs autour de Christiane B. Schaffitzel (European Molecular Biology Laboratory<\/i>, Grenoble et University of Bristol<\/i>) en combinant l\u2019utilisation de la cryomicroscopie \u00e9lectronique et de la diffusion de neutrons aux petits angles (Small-Angle Neutron Scattering, SANS<\/i>). Les \u00e9chantillons \u00e9taient \u00ab vitrifi\u00e9s \u00bb par cong\u00e9lation ultra-rapide \u00e0 \u2013 196\u00b0C, afin d\u2019\u00e9viter que les fragiles structures biologiques ne soient endommag\u00e9es par la formation de cristaux de glace. Des images \u00e0 tr\u00e8s haute r\u00e9solution du translocon ont \u00e9t\u00e9 obtenues par cryomicroscopie \u00e9lectronique. Dans la technique SANS, l\u2019\u00e9chantillon en solution dans un m\u00e9lange H2<\/sub>O\/D2<\/sub>O est bombard\u00e9 avec un faisceau de neutrons ; ces particules interagissent avec les noyaux atomiques y compris avec ceux d\u2019atomes l\u00e9gers (hydrog\u00e8ne). Dans la membrane cytoplasmique, le translocon est un super complexe. La pr\u00e9sence d\u2019eau lourde (D2<\/sub>O) rend certaines parties de ce super complexe invisibles. On mesure la d\u00e9viation des neutrons aux faibles angles (de 0,1 \u00e0 10 degr\u00e9s) en utilisant la substitution isotopique hydrog\u00e8ne\/deut\u00e9rium pour modifier le contraste des images, en faisant varier les proportions de D2<\/sub>O dans le m\u00e9lange H2<\/sub>O\/D2<\/sub>O. La technique non destructive SANS a permis de mesurer la taille, la forme et la position des constituants du super complexe \u00e0 l\u2019\u00e9chelle nanom\u00e9trique.<\/p>\n

Les r\u00e9sultats de ces travaux ont permis de mod\u00e9liser l\u2019accrochage du ribosome au translocon, la formation du complexe RNC (Ribosome Nascent Chain<\/i>)\/Sec61, et le passage des polypeptides naissants \u2013 ou l\u2019insertion des prot\u00e9ines membranaires \u2013 \u00e0 travers une chambre centrale de nature lipidique. L\u2019ouverture et la fermeture du translocon sont r\u00e9gul\u00e9es par des s\u00e9quences topog\u00e9niques : peptide signal, s\u00e9quence hydrophobe stop transfert<\/i>. Apr\u00e8s compl\u00e9tion de la d\u00e9charge vectorielle du polypeptide, le canal se referme. Pour les prot\u00e9ines membranaires, apr\u00e8s fermeture du pore, le ribosome se d\u00e9tache de la membrane et poursuit la synth\u00e8se de la portion cytosolique du polypeptide. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Van den Berg B, Clemons Jr WM, Collinson I, Modis Y, Hartmann E, Harrison SC, Rapoport TA X-ray structure of a protein-conducting channel<\/i> (2004)
\nGulbart J, Schulten K Molecular Dynamics Studies of the Archaeal Translocon<\/i> (2006)
\nKumazaki K, Kishimoto T, Furukawa A, Mori H, Tanaka Y, Dohmae N, Ishitani R, Tsukazaki A, Nureki O Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase<\/i> (2014)
\nBotte M, Zaccai NR, Nijeholt JLA, Martin R, Knoops K, Papai G, Zou J, Deniau A, Karuppasamy M, Jiang Q, Roy AS, Schulten K, Schultze P, Rappsilber J, Zaccai G, Berger I, Collinson I, Schaffitzel C A central cavity within the holo-translocon suggests a mechanism for membrane protein insertion<\/i> (2016)
\nMartin R, Larsen AH, Corey RA, Midtgaard S R, Frielinghaus H, Schaffitzel C, Arleth L, Collinson I Structure and Dynamics of the Central Lipid Pool and Proteins of the Bacterial Holo-Translocon<\/i> (2019)<\/p>\n

Autres r\u00e9f\u00e9rences sur le translocon : Van den Berg B, Clemons Jr WM, Collinson I, Modis Y, Hartmann E, Harrison SC, Rapoport TA X-ray structure of a protein-conducting channel (2004)
\nGulbart J, Schulten K Molecular Dynamics Studies of the Archaeal Translocon<\/i> (2006)
\nKumazaki K, Kishimoto T, Furukawa A, Mori H, Tanaka Y, Dohmae N, Ishitani R, Tsukazaki A, Nureki O Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase<\/i> (2014)<\/p>\n

<\/a>Microsomes<\/b><\/span><\/h3>\n

Le terme \u00ab microsomes \u00bb a une connotation op\u00e9rationnelle ; il d\u00e9signe la fraction particulaire obtenue par centrifugation d\u2019un surnageant post-mitochondrial \u00e0 vitesse \u00e9lev\u00e9e (40.000 rpm pendant 30 \u00e0 60 minutes ou plus, selon les auteurs) dans un rotor angulaire (rotor Spinco 40). Les premi\u00e8res tentatives pour identifier par microscopie \u00e9lectronique les composants des microsomes furent entreprises dans les ann\u00e9es 1950 par David B. Slautterback (Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York<\/i>) et par George E. Palade (Rockefeller Institue, New York<\/i>). En 1956, George Palade et Philip Siekevitz identifi\u00e8rent les trois composants principaux des microsomes de foie de rat et du pancr\u00e9as de cobaye : les v\u00e9sicules lisses ou rugueuses d\u00e9rivant de la fragmentation du r\u00e9ticulum endoplasmique et les ribosomes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Slautterback DB Electron microscopic studies of small cytoplasmic particles (microsomes) <\/i> (1953)
\nPalade GE A small particulate component of the cytoplasm<\/i> (1955)
\nPalade GE, Siekevitz P Liver microsomes: an integrated morphological and biochemical study<\/i> (1956)
\nPalade GE, Siekevitz P Pancreatic microsomes: an integrated morphological and biochemical study<\/i> (1956)<\/p>\n

Dans un article publi\u00e9 en 1962, Palade et Lars Ernster \u00e9crivent : \u00ab It is well established that the microsomal fraction isolated from rat liver by usual differential centrifugation from rat liver homogenates consists of vesicular and tubular fragments of the endoplasmic reticulum.<\/i> \u00bb Cette affirmation \u00e9tait temp\u00e9r\u00e9e dans la discussion : les auteurs \u00e9voquaient la pr\u00e9sence possible d\u2019\u00e9l\u00e9ments de la membrane p\u00e9ri cellulaire. Dans un article ant\u00e9rieur (1956), ces m\u00eames auteurs avaient \u00e9voqu\u00e9 la pr\u00e9sence d\u2019\u00e9l\u00e9ments du complexe de Golgi dans la fraction microsomiale. Il faut voir dans ces affirmations de scientifiques reconnus l\u2019origine de la confusion, qui a perdur\u00e9 jusqu\u2019au milieu des ann\u00e9es 1970, entre microsomes (la fraction subcellulaire) et reticulum endoplasmique (l\u2019organite).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Ernster L, Siekevitz P, Palade GE Enzyme-structure Relationships in the Endoplasmic Reticulum of Rat Liver : A Morphological and Biochemical Study<\/i> (1962)<\/p>\n

La composition membranaire de la fraction microsomes d\u00e9pend de fa\u00e7on critique de la fa\u00e7on dont elle a \u00e9t\u00e9 pr\u00e9par\u00e9e. Si l\u2019objectif est d\u2019obtenir des microsomes repr\u00e9sentatifs du reticulum endoplasmique, il est imp\u00e9ratif de respecter toutes les \u00e9tapes du fractionnement en pr\u00e9parant d\u2019abord une fraction nucl\u00e9aire, puis une fraction mitochondriale et enfin des microsomes par centrifugation du surnageant post-mitochondrial. Il est imp\u00e9ratif de proc\u00e9der \u00e0 un \u00ab lavage \u00bb de chaque culot : remise en suspension et centrifugation. Cette \u00e9tape doit \u00eatre effectu\u00e9e deux fois pour chaque culot. Elle diminue la contamination du culot nucl\u00e9aire par les organites de la fraction mitochondriale (mitochondries, lysosomes, peroxysomes). La vitesse de rotation du rotor, et par cons\u00e9quent la force centrifuge, est calcul\u00e9e pour qu\u2019une particule de la taille d\u2019un noyau (5-7 microm\u00e8tres de diam\u00e8tre) parcourt la distance s\u00e9parant le m\u00e9nisque du liquide du fond du tube du rotor. Dans ces conditions, une particule de la taille d\u2019une mitochondrie (3 microm\u00e8tres) se trouvant au milieu du tube au d\u00e9but de la centrifugation atteindrait le culot. La remise en suspension suivie de centrifugation, diminue donc la contamination inh\u00e9rente au modus operandi<\/i>, bien qu\u2019un certain nombre d\u2019exp\u00e9rimentateurs pr\u00e9parent le surnageant post-mitochondrial par s\u00e9dimentation \u00ab en bloc \u00bb des fractions nucl\u00e9aire et mitochondriale. La recommandation de pr\u00e9parer s\u00e9par\u00e9ment ces deux fractions peut para\u00eetre triviale, mais elle est essentielle. En 1974, avec Henri Beaufay et un certain nombre de coll\u00e8gues, nous avons publi\u00e9 une s\u00e9rie d\u2019articles d\u00e9crivant nos r\u00e9sultats : sur la base de la proportion des enzymes marqueurs des diff\u00e9rents types de membrane, nous avons calcul\u00e9 que dans les microsomes tels que nous les pr\u00e9parons 77% des prot\u00e9ines proviennent du reticulum endoplasmique. La fraction contient 75% de la glucose 6-phosphatase de l\u2019homog\u00e9nat, un enzyme marqueur du reticulum. Les 23% de prot\u00e9ines microsomiales restant viennent de la membrane p\u00e9ricellulaire (8%), des mitochondries (4,9%), du complexe de Golgi (4,3%), des peroxysomes (0,8%) et des lysosomes (0,5%). <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Beaufay H, Amar-Costesec A, Feytmans E, Thin\u00e8s-Sempoux D, Wibo M, Robbi M, Berthet J Analytical study of microsomes and isolated subcellular membranes from rat liver. I. Biochemical Methods<\/i> (1974)
\nAmar-Costesec A, Beaufay H, Wibo M, Thin\u00e8s-Sempoux D, Feytmans E, Robbi M, Berthet J Analytical study of microsomes and isolated subcellular membranes from rat liver. II. Preparation and composition of the microsomal fraction<\/i> (1974)
\nBeaufay H, Amar-Costesec A, Thin\u00e8s-Sempoux D, Wibo M, Robbi M, Berthet J Analytical Study of Microsomes and Isolated Subcellular Membranes from Rat Liver. III. Subfractionation of the Microsomal Fraction by Isopycnic and Differential Centrifugation in Density Gradients<\/i> (1974)<\/p>\n

Loin de l\u2019affirmation de Lars Ernster et de Gustav Dallner (Karolinska Institutet, Stockholm<\/i>) dans leur article de revue de 1968 : \u00ab The pellet constituents vary according to the tissue of origin : thus rough and smooth ER membranes are practically the only pellet constituent from liver tissue\u2026<\/i> \u00bb, les microsomes de foie de rat contiennent, en plus des v\u00e9sicules d\u00e9rivant du reticulum endoplasmique, les membranes de deux autres compartiments \u2013 le complexe de Golgi et la membrane plasmique -, ainsi qu\u2019une proportion non n\u00e9gligeable de gros granules (mitochondries lysosomes, peroxysomes). La teneur en ARN (0,10 mg par mg de prot\u00e9ine) traduit l\u2019absence \u00e0 peu pr\u00e8s compl\u00e8te de polysomes libres dans nos microsomes. Le crit\u00e8re ARN\/prot\u00e9ine fut utilis\u00e9 pour la premi\u00e8re fois par Abert Claude, le d\u00e9couvreur des microsomes, et repris par Jean Chauveau et coll. (Centre de Recherches sur la Cellule Normale et Canc\u00e9reuse, \u00e0 Villejuif). Il faut se souvenir que pendant longtemps la seule fonction attribu\u00e9e aux microsomes a \u00e9t\u00e9 la synth\u00e8se prot\u00e9ique. Dans la litt\u00e9rature, figurent des valeurs comprises entre 0,07 et 0,27 mg d\u2019ARN par mg de prot\u00e9ine. Ces diff\u00e9rences de 1 \u00e0 4, refl\u00e8tent la variabilit\u00e9 des conditions d\u2019obtention des microsomes obtenus par diff\u00e9rents auteurs. Un rapport de 0,27 mg d\u2019ARN par mg de prot\u00e9ine caract\u00e9rise des microsomes fortement contamin\u00e9s par des polysomes libres.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Dallner G, Ernster L Subfractionation and composition of microsomal membranes: a review<\/i> (1968)
\nChauveau J, Moul\u00e9 Y, Rouiller C, Schneebeli J Isolation of smooth vesicles and free ribosomes from rat liver microsomes<\/i> (1962)<\/p>\n

<\/a>Microsomes lisses, microsomes rugueux
\nLes id\u00e9es simplistes ont la vie dure<\/b><\/span><\/h3>\n

L\u2019examen au microscope \u00e9lectronique de coupes de tissus h\u00e9patique ou pancr\u00e9atique a r\u00e9v\u00e9l\u00e9 que le reticulum endoplasmique est form\u00e9e de portions lisses, d\u00e9pourvues de ribosomes, et de portions rugueuses, portant des ribosomes attach\u00e9s \u00e0 la face cytoplasmique de la membrane. La fragmentation en v\u00e9sicules du reticulum endoplasmique lors de l\u2019homog\u00e9n\u00e9isation du tissus fut le point de d\u00e9part de nombreuses tentatives de s\u00e9paration des v\u00e9sicules lisses ou rugueuses. L\u2019on attribuait aux deux populations des fonctions sp\u00e9cifiques : la synth\u00e8se prot\u00e9ique pour les v\u00e9sicules rugueuses et le m\u00e9tabolisme des x\u00e9nobiotiques (voir plus loin) pour les v\u00e9sicules lisses. La m\u00e9thode la plus rapide et la plus directe pour effectuer cette s\u00e9paration faisait appel \u00e0 la centrifugation sur des couches de saccharose de densit\u00e9 d\u00e9croissante, superpos\u00e9es dans le tube d\u2019un rotor. La densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilbre dans le saccharose des v\u00e9sicules lisses est comprise entre 1,05 et 1,18, et celle des v\u00e9sicules rugueuses, entre 1,18 et 1,25 g.cm-3<\/sup>. Il suffisait donc de choisir en fonction de ces donn\u00e9es la densit\u00e9 des deux (ou plus) couches de saccharose. Dans le cas le plus simple (deux couches de saccharose), apr\u00e8s centrifugation pendant une dur\u00e9e d\u00e9termin\u00e9e, g\u00e9n\u00e9ralement assez longue, on voyait se former \u00e0 l\u2019interface des deux couches une bande de microsomes lisses, et au fond du tube, un culot de microsomes rugueux. Le probl\u00e8me avec cette m\u00e9thode de s\u00e9paration sur \u00ab gradient discontinu \u00bb, c\u2019est que les pr\u00e9misses \u00e9taient fausses.<\/p>\n

A l\u2019issue d\u2019un m\u00e9ticuleux travail de morphologie quantitative, Maurice Wibo d\u00e9montra, en 1971, que la charge en ribosomes des v\u00e9sicules couvre tout le spectre allant de la v\u00e9sicule lisse \u00e0 celle ayant la charge maximale en ribosomes. Il n\u2019y a donc pas deux populations distinctes sur la base de la charge en ribosomes des v\u00e9sicules. Apr\u00e8s centrifugation en gradient lin\u00e9aire de saccharose, les enzymes marqueurs du reticulum endoplasmique (glucose 6-phosphatase et NADPH-cytochrome c<\/i> r\u00e9ductase) sont distribu\u00e9s dans la totalit\u00e9 du gradient, de la densit\u00e9 1,10 \u00e0 la densit\u00e9 1,27g.cm3<\/sup>. Ces distributions \u00e9tal\u00e9es refl\u00e9tent le caract\u00e8re \u00ab polydisperse \u00bb des v\u00e9sicules : elles s\u2019\u00e9quilibrent dans le gradient en fonction de leur charge en ribosomes, les v\u00e9sicules lisses dans la portion l\u00e9g\u00e8re du gradient et les v\u00e9sicules \u00e0 forte charge en ribosomes dans la partie du gradient o\u00f9 la densit\u00e9 est la plus \u00e9lev\u00e9e ; entre les deux, s\u2019\u00e9tale un spectre continu de v\u00e9sicules dont la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre cro\u00eet proportionnellement \u00e0 la charge en ribosomes. Ce r\u00e9sultat invalide la signification des r\u00e9sultats exp\u00e9rimentaux \u00e9tablissant un lien entre les propri\u00e9t\u00e9s biochimiques et enzymatiques des microsomes et leur caract\u00e8re lisse ou rugueux. La centrifugation sur couches de saccharose de densit\u00e9s diff\u00e9rentes pour s\u00e9parer deux populations de v\u00e9sicules, pratiqu\u00e9e dans de nombreux laboratoires, introduit une coupure arbitraire au sein d\u2019une population continue de v\u00e9sicules dont les propri\u00e9t\u00e9s biochimiques varient en proportion mais pas en nature ; il y a moins d\u2019oxyg\u00e9nases \u00e0 fonction mixte dans les v\u00e9sicules tr\u00e8s rugueuses que dans les v\u00e9sicules lisses, mais il y en a.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Wibo M, Amar-Costesec A, Berthet J, Beaufay H Electron Microscope Examination of Subcellular Fractions. III. Quantitative Analysis of the Microsomal Fraction Isolated from Rat Liver<\/i> (1971)<\/span><\/p>\n

<\/a>\u00ab Membrane flow <\/i>\u00bb versus <\/i>
\nHomog\u00e9n\u00e9it\u00e9 biochimique des membranes<\/b><\/span><\/h3>\n

Au cours de la d\u00e9cennie 1960-1970, plusieurs groupes de chercheurs ont purifi\u00e9 des membranes cellulaires et \u00e9tabli leur composition biochimique. La membrane p\u00e9ricellulaire, isol\u00e9e en 1960 par David M. Neville (Department of Pathology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry<\/i>), renferme des enzymes hydrolysant les liaisons ester- ou diester-phosphate (phosphatase alcaline, phosphodiest\u00e9rase alcaline I, 5\u2019-nucl\u00e9otidase) ; cette derni\u00e8re hydrolyse les nucl\u00e9otides puriques, ad\u00e9nine et guanine. Le complexe de Golgi, isol\u00e9 en 1969 par Rebecca Fleischer, Sidney Fleisher et Hidehiro Ozawa (Department of Molecular Biology, Vanderbilt University, Nashville<\/i>) contient les galactosyl- et sialyltransf\u00e9rases. La membrane externe des mitochondries, isol\u00e9e par D.F. Parsons, G.R. Williams et Britton Chance (Department of Biophysics and Physical Biochemistry, Johnson Foundation, University of Pennsylvania, Philadelphia<\/i>), renferme la monoamine oxydase, une oxydase \u00e0 fonction mixte catalysant l\u2019oxydation des monoamines biologiques comme la s\u00e9rotonine. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Neville DM The Isolation of a Cell Membrane Fraction from Rat Liver<\/i> (1960)
\nFleischer R, Fleisher S, Ozawa H Isolation and characterization of Golgi membranes from bovine liver<\/i> (1969)
\nParsons DF, Williams GR, Chance B Characteristics of isolated and purified preparations of the outer and inner membranes of mitochondria<\/i> (1966)<\/p>\n

La glucose 6-phosphatase (une phosphatase participant \u00e0 la r\u00e9gulation du taux sanguin de glucose) et la NADPH cytochrome c r\u00e9ductase (une oxydor\u00e9ductase de la cha\u00eene respiratoire du reticulum endoplasmique) ont leur pic d\u2019activit\u00e9 sp\u00e9cifique le plus \u00e9lev\u00e9 dans les microsomes, dont le composant principal d\u00e9rive de la fragmentation en v\u00e9sicules du reticulum endoplasmique. Chaque pr\u00e9paration membranaire prise individuellement renferme des enzymes qui lui sont sp\u00e9cifiques mais aussi une certaine proportion d\u2019enzymes caract\u00e9ristiques des autres types membranaires. Il y a deux interpr\u00e9tations possibles \u00e0 cet \u00e9tat de fait : (i) soit on suppose que ces enzymes caract\u00e9ristiques des autres types membranaires contaminent les pr\u00e9parations les plus \u00ab pures \u00bb que l\u2019on puisse obtenir ; (ii) soit un enzyme donn\u00e9 n\u2019est pas exclusivement associ\u00e9 \u00e0 un seul type de membrane. En d\u2019autres termes, les diff\u00e9rents compartiments membranaires diff\u00e9rent-ils entre eux qualitativement ou quantitativement ? La r\u00e9ponse \u00e0 cette question est cruciale pour concevoir un m\u00e9canisme de la biogen\u00e8se des membranes et, d\u2019une mani\u00e8re plus g\u00e9n\u00e9rale, des diff\u00e9rents compartiments de la cellule. La premi\u00e8re hypoth\u00e8se \u00e9tait celle qui avait la faveur des membres du Groupe de Louvain, conform\u00e9ment au postulat d\u2019homog\u00e9n\u00e9it\u00e9 sur lequel Jacques Berthet et Christian de Duve avaient fond\u00e9 l\u2019approche quantitative du fractionnement subcellulaire. L\u2019analyse de la fraction des gros granules, qui avait conduit \u00e0 la d\u00e9couverte des lysosomes et des peroxysomes, avait \u00e9t\u00e9 conduite en appliquant ce postulat. La seconde hypoth\u00e8se semblait \u00eatre en faveur parmi les microscopistes du groupe de George Palade. En 1974, Marylin Farquhar a rapport\u00e9 la pr\u00e9sence de phosphatase acide, un enzyme des lysosomes, d\u2019ad\u00e9nylate cyclase et de 5\u2019-nucl\u00e9otidase, deux enzymes de la membrane plasmique, dans le complexe de Golgi. Des localisations multiples furent rapport\u00e9es par d\u2019autres membres du groupe. De ces r\u00e9sultats, on pouvait conclure que les membranes des diff\u00e9rents types pr\u00e9sentaient entre elles des diff\u00e9rences quantitatives et non qualitatives. Le \u00ab model of flow-differentiation<\/i> \u00bb (ou \u00ab membrane flow<\/i> \u00bb), formul\u00e9 par D. James Morr\u00e9 (Department of Chemistry and Pharmacology, Purdue University, West Lafayette<\/i>) \u00e9tait l\u2019interpr\u00e9tation pouss\u00e9e \u00e0 l\u2019extr\u00eame de cette option : il existerait un gradient de concentration en enzymes le long de la voie s\u00e9cr\u00e9toire, de l\u2019enveloppe nucl\u00e9aire \u00e0 la membrane plasmique ; la teneur en glucose 6-phosphatase, \u00e9lev\u00e9e dans la membrane externe de l\u2019enveloppe nucl\u00e9aire, irait en diminuant du reticulum endoplasmique au complexe de Golgi et du complexe de Golgi \u00e0 la membrane p\u00e9ri cellulaire ; \u00e0 l\u2019inverse la concentration en 5\u2019-nucl\u00e9otidase irait en d\u00e9croissant de la membrane plasmique au complexe de Golgi et au reticulum endoplasmique. Au cours de ce processus, les compartiments de la cha\u00eene d\u2019assemblage et de transport des prot\u00e9ines (reticulum endoplasmique, complexe de Golgi, membrane p\u00e9ricellulaire) \u00e9tablissent entre eux des continuit\u00e9s anatomiques, au moins transitoires. Si l\u2019on prend en compte la fluidit\u00e9 de la bicouche lipidique, on se demande \u00e0 juste titre comment ces compartiments acqui\u00e8rent et maintiennent une stricte individualit\u00e9 biochimique.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Farquhar MG, Bergeron JJM, Palade GE Cytochemistry of Golgi fractions prepared from rat liver<\/i> (1974)
\nCheng H, Farquhar MG Presence of adenylate cyclase activity in Golgi and other fractions from rat liver. II. Cytochemical localization within Golgi and ER membranes<\/i> (1976)
\nBorghese N, Meldolesi J Localization and biosynthesis of NADH cytochrome b5 reductase, an integral membrane protein, in rat liver cells. I. Distribution of the enzyme activity in microsomes, mitochondria, and Golgi complex<\/i> (1980)
\nHowell KE, Ito A, Palade GE Endoplasmic marker enzymes in Golgi fractions. What does this mean?<\/i> (1978)
\nIto A, Palade GE Presence of NADPH-cytochrome P450 reductase in rat liver Golgi membranes. Evidence obtained by immunoadsorption method<\/i> (1978)
\nWidnell CC Cytochemical localization of 5\u2019-nucleotidase in subcellular fractions isolated from rat liver. I. The origin of 5\u2019-nucleotidase activity in microsomes<\/i> (1972)
\nJarash ED, Kartenbeck J, Bruder G, Fink A, Morr\u00e9 DJ, Franke WW B-type cytochromes in plasma membranes isolated from rat liver, in comparison with those of endomembranes<\/i> (1979)<\/p>\n

En mai 1979, G\u00fcnter Blobel (Department of Cell Biology, The Rockefeller University, New York<\/i>) et David Sabatini (New York University Medical Center<\/i>) ont organis\u00e9 au Cold Spring Harbor Laboratory<\/i> un colloque sur le th\u00e8me \u201cMembrane Biogenesis<\/i>\u201d. A cette r\u00e9union, je pr\u00e9sentais notre travail avec Maurice Wibo, Dani\u00e8le Godelaine et Denise Thines-Sempoux \u2013 qui ne sera publi\u00e9 que deux ans plus tard dans The Journal of Cell Biology<\/i>. L\u2019homog\u00e9n\u00e9isation du tissu h\u00e9patique provoque la fragmentation de la membrane plasmique : la moiti\u00e9 des fragments \u2013 les plus grands \u2013 s\u00e9dimentent avec les noyaux ; l\u2019autre moiti\u00e9, ceux d\u00e9rivant de la membrane en contact avec l\u2019espace de Disse et le plasma sanguin, s\u00e9dimentent dans les microsomes. Apr\u00e8s \u00e9quilibration des microsomes en gradient de saccharose, les enzymes marqueurs de la membrane plasmique (5\u2019-nucl\u00e9otidase, phosphatase alcaline, phosphodiest\u00e9rase alcaline I) s\u2019\u00e9quilibrent \u00e0 la densit\u00e9 1,14, ou 1,17 s\u2019il s\u2019agit d\u2019une pr\u00e9paration purifi\u00e9e de membrane plasmique (qui contient davantage de jonctions serr\u00e9es, plus riches en prot\u00e9ines et donc plus denses que la zone des villosit\u00e9s en contact avec le plasma). Nous avons montr\u00e9 que les fragments de membrane plasmique pr\u00e9sentent deux propri\u00e9t\u00e9s singuli\u00e8res : en pr\u00e9sence de digitonine, leur densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre augmente (\u00ab digitonin shift<\/i>\u00bb) ; l\u2019addition de cette saponine aux microsomes (une mole de saponine par mole de cholest\u00e9rol) provoque une augmentation de la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre des marqueurs de ce groupe de 0,03 \u00e0 0,04 g.cm3<\/sup>. Les fragments de membrane plasmique trait\u00e9s \u00e0 la digitonine pr\u00e9sentent un aspect caract\u00e9ristique. L\u2019examen au microscope \u00e9lectronique permet de les distinguer des autres membranes par leur aspect \u00ab fenestr\u00e9 \u00bb, probablement d\u00fb \u00e0 des d\u00e9p\u00f4ts de complexes digitonine-cholest\u00e9rol. Ces deux propri\u00e9t\u00e9s s\u2019observent aussi bien avec les microsomes qu\u2019avec des pr\u00e9parations purifi\u00e9es de membrane plasmique. Si la 5\u2019-nucl\u00e9otidase et les autres enzymes de la membrane plasmique que l\u2019on trouve dans des pr\u00e9parations purifi\u00e9es de complexe de Golgi ou de membrane externe de mitochondries appartiennent vraiment \u00e0 ces entit\u00e9s subcellulaires, ils ne devraient pas pr\u00e9senter de digitonin shift<\/i> et l\u2019on ne devrait pas trouver de fragments membranaires \u00e0 l\u2019aspect fenestr\u00e9. Le fait que ces deux particularit\u00e9s se retrouvent dans ces pr\u00e9parations purifi\u00e9es plaide en faveur d\u2019une contamination par des fragments de membrane plasmique. Si cela n\u2019avait pas \u00e9t\u00e9 le cas et si le m\u00eame enzyme (la 5\u2019-nucl\u00e9otidase, par exemple) avait appartenu \u00e0 plus d\u2019un type membranaire, il se comporterait de fa\u00e7on variable en fonction de la pr\u00e9paration membranaire analys\u00e9e. Avec le m\u00eame type d\u2019approche utilisant un \u00ab perturbateur de densit\u00e9 \u00bb, il fut possible de montrer que le reticulum endoplasmique ne renferme pas de 5\u2019-nucl\u00e9otidase. Dans ce cas, le perturbateur de densit\u00e9 n\u2019\u00e9tait pas la digitonine mais le pyrophosphate (ou un ch\u00e9lateur de cations comme l\u2019EDTA) qui d\u00e9tache les ribosomes li\u00e9s aux v\u00e9sicules microsomiales rugueuses d\u00e9rivant du reticulum endoplasmique. Ce traitement provoque un all\u00e8gement significatif de ces v\u00e9sicules, se traduisant par une densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre moins \u00e9lev\u00e9e pour les marqueurs enzymatiques du reticulum (glucose 6-phosphatase, est\u00e9rase, UDP glucuronosyltranf\u00e9rase), mais pas pour la 5\u2019-nucl\u00e9otidase. Le traitement des microsomes successivement par la digitonine et le pyrophosphate, provoquait une augmentation de la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre de la 5\u2019nucl\u00e9otidase et une diminution de celle de la glucose 6-phosphatase, excluant toute association de la 5\u2019-nucl\u00e9otidase au reticulum endoplasmique.<\/p>\n

C\u2019est peu de dire qu\u2019\u00e0 la fin de ma pr\u00e9sentation la discussion fut anim\u00e9e. A titre d\u2019illustration des divergences de point de vue, je cite dans en r\u00e9f\u00e9rence le titre de l\u2019expos\u00e9 de Nica Borghese (C.N.R. Center of Cytopharmacology, University of Milan<\/i>) dans lequel elle conclut \u00e0 la pr\u00e9sence de NADH cytochrome b5<\/sub><\/i> reductase dans le reticulum endoplasmique, la membrane mitochondriale externe et le complexe de Golgi. Par contre, David Sabatini et G\u00fcnter Blobel saisirent la signification de nos r\u00e9sultats dans l\u2019optique de leur \u00ab hypoth\u00e8se du signal \u00bb (Signal Hypothesis<\/i>) propos\u00e9e en 1971 : la liaison du ribosome \u00e0 la membrane du reticulum endoplasmique d\u00e9pend de la pr\u00e9sence d\u2019un \u00ab signal \u00bb port\u00e9 par le peptide en cours de synth\u00e8se. En d\u2019autres termes, les polypeptides sont dot\u00e9s d\u2019une \u00ab adresse \u00bb, d\u2019un \u00ab code postal \u00bb stipulant leur destination finale dans ou hors de la cellule. Cela implique que la membrane de destination du polypeptide synth\u00e9tis\u00e9 \u2013 et elle seule<\/b> \u2013 poss\u00e8de le r\u00e9cepteur ad hoc reconnaissant le signal. La notion de diff\u00e9rence qualitative entre membranes de diff\u00e9rents types \u00e9tait compatible avec cette hypoth\u00e8se.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Amar-Costesec A, Beaufay H, de Duve C The distribution of enzymes in subcellular membranes from rat liver<\/i> (1979) Abstracts of papers presented at the meeting on Membrane biogenesis<\/i>
\nWibo M, Thin\u00e8s-Sempoux D, Amar-Costesec A, Beaufay H, Godelaine D Analytical Study of Microsomes and Isolated Subcellular Membranes from Rat Liver. VIII. Subfractionation of preparations enriched with plasma membranes outer mitochondrial membranes, or Golgi complex membranes<\/i> (1981)
\nBorghese N, Meldolesi J Biogenesis and turnover of NADH cytochrome b5 reductase, a membrane protein with multiple localization in rat hepatocytes<\/i> (1979) Abstracts of papers presented at the meeting on Membrane biogenesis<\/i>
\nThin\u00e8s-Sempoux D, Amar-Costesec A, Beaufay H, Berthet J The Association of Cholesterol, 5\u2019-Nucleotidase and Alkaline Phosphodiesterase I with a Distinct Group of Microsomal Particles<\/i> (1969)
\nAmar-Costesec A, Wibo M, Thin\u00e8s-Sempoux D, Beaufay H, Berthet J Analytical Study of Microsomes ans Isolated Subcellular Membranes from Rat Liver. IV. Biochemical, Physical and Morphological Modifications of Microsomal Components Induced by Digitonin, EDTA and Pyrophosphate<\/i> (1974)<\/p>\n

<\/a>H\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique du reticulum endoplasmique<\/b><\/span><\/h3>\n

L\u2019observation au microscope \u00e9lectronique a r\u00e9v\u00e9l\u00e9 que, dans les h\u00e9patocytes, le reticulum endoplasmique est un vaste r\u00e9seau membranaire (plusieurs m2<\/sup> par g de foie) qui s\u2019\u00e9tend de la membrane nucl\u00e9aire externe jusqu\u2019au complexe de Golgi ; ce r\u00e9seau pr\u00e9sente une h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 morphologique marqu\u00e9e, entre r\u00e9gions rugueuses et r\u00e9gions lisses. Le reticulum endoplasmique rugueux se pr\u00e9sente sous forme d\u2019un empilement de saccules portant des ribosomes sur leur face externe ; il est en continuit\u00e9 avec une membrane portant progressivement de moins en moins de ribosomes jusqu\u2019\u00e0 devenir compl\u00e8tement lisse ; les membranes parall\u00e8les, rigides, encadrant un lumen \u00e9troit du reticulum rugueux c\u00e8dent la place \u00e0 des membranes souples, avec de nombreuses circonvolutions et qui se terminent par des tubules et des v\u00e9sicules au voisinage du complexe de Golgi.<\/p>\n

Le sous-fractionnement analytique des microsomes de foie de rat par centrifugation en gradient de densit\u00e9 a fourni des informations quantitatives sur la distribution des enzymes du reticulum endoplasmique entre les portions lisses et rugueuses. Maurice Wibo et coll. (International Institute of Cellular and Molecular Pathology<\/i>, Bruxelles) ont d\u00e9montr\u00e9 que la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre des v\u00e9sicules microsomales est principalement d\u00e9termin\u00e9e par leur charge en ribosomes : les fractions de faible densit\u00e9 renferment des v\u00e9sicules lisses ne portant pas de ribosomes ; les fractions de densit\u00e9 \u00e9lev\u00e9e contiennent des v\u00e9sicules \u00e0 forte charge en ribosomes ; entre les deux, existe un spectre continu de v\u00e9sicules dont la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre cro\u00eet proportionnellement \u00e0 leur contenu en ARN.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Wibo M, Amar-Costesec A, Berthet J, Beaufay H Electron Microscope Examination of Subcellular Fractions. III. Quantitative Analysis of the Microsomal Fraction Isolated from Rat Liver<\/i> (1971)
\nWibo M, Amar-Costesec A, Berthet J, Beaufay H Morphometric Analysis of Rat Liver Microsomes<\/i> (1973)<\/p>\n

Lorsque l\u2019on centrifuge des fractions mitochondriales, lysosomales, ou peroxysomales dans un gradient de saccharose, jusqu\u2019\u00e0 l\u2019\u00e9quilibre isopycnique, les enzymes des organites de ces fractions pr\u00e9sentent des profils de distribution de densit\u00e9 semblables ; ce n\u2019est pas le cas pour le r\u00e9ticulum endoplasmique de la fraction microsomale. Apr\u00e8s centrifugation dans un gradient lin\u00e9aire de saccharose, la distribution lat\u00e9rale des enzymes du reticulum est h\u00e9t\u00e9rog\u00e8ne ; cependant, les diff\u00e9rences d\u2019activit\u00e9s enzymatiques entre microsomes lisse et rugueux sont quantitatives et pas qualitatives, et la transition du caract\u00e8re lisse au caract\u00e8re rugueux est graduelle. De plus, il existe une certaine homog\u00e9n\u00e9it\u00e9 puisque seulement deux modes de distribution ont \u00e9t\u00e9 observ\u00e9s : (i) les flavoprot\u00e9ines \u2013 NADH cytochrome b<\/i>5<\/sub> et NADPH cytochrome P-450 r\u00e9ductases – et les cytochromes b<\/i>5<\/sub> et P-450 ont des profils de distribution presque identiques, avec un pic \u00e0 la densit\u00e9 1,14 ; c\u2019est la densit\u00e9 modale des v\u00e9sicules lisses issues de la fragmentation du reticulum pendant le broyage des tissus ; leur activit\u00e9 sp\u00e9cifique diminue quand la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre augmente ; ces enzymes forment ce que, dans nos exp\u00e9riences, nous avons appel\u00e9 \u00ab groupe b \u00bb (ii) la glucose 6-phosphatase, l\u2019UDP glucuronosyl transf\u00e9rase, la nucl\u00e9oside diphosphatase et les est\u00e9rases se r\u00e9partissent le long du gradient, de la densit\u00e9 1,10 \u00e0 la densit\u00e9 1,25 ; leur activit\u00e9 sp\u00e9cifique est assez uniforme. Ces enzymes forment le \u00ab groupe c \u00bb. Finalement, le rapport ARN\/prot\u00e9ine augmente avec la densit\u00e9 et pr\u00e9sente un pic \u00e0 la densit\u00e9 1,23.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Beaufay H, Amar-Costesec A, Thin\u00e8s-Sempoux D, Wibo M, Robbi M, Berthet J Analytical Study of Microsomes and Isolated Subcellular Membranes from Rat Liver. III. Subfractionation of the Microsomal Fraction by Isopycnic and Differential Centrifugation in Density Gradients<\/i> (1974)<\/p>\n

Lorsque j\u2019ai propos\u00e9, en 1977, un mod\u00e8le structural pour rendre compte de l\u2019h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique du reticulum, aucun enzyme ne pr\u00e9sentait un mode de distribution semblable \u00e0 celui de l\u2019ARN. Dans les ann\u00e9es qui ont suivi, j\u2019ai tent\u00e9 de combler cette lacune et de d\u00e9couvrir la nature des prot\u00e9ines du \u00ab domaine ribosomal \u00bb de la membrane du reticulum endoplasmique Avec John A. Todd et Eugene Marcantonio (Department of Cell Biology, New York University School of Medicine<\/i>) nous avons montr\u00e9 que les ribophorines I et II, des glycoprot\u00e9ines transmembranaires de type I ; pr\u00e9sentent le m\u00eame mode de distribution que l\u2019ARN. Marcantonio a d\u00e9montr\u00e9 qu\u2019il en va de m\u00eame pour les sites de fixation in vitro<\/i> des ribosomes. Bernard Dublet (International Institute of Cellular and Molecular Pathology<\/i>, Bruxelles), a \u00e9tabli que le r\u00e9cepteur de la particule de reconnaissance du signal et la peptidase du signal ont aussi le m\u00eame profil de distribution de l\u2019ARN. Avec Michael Hortsch, nous avons montr\u00e9 que la prot\u00e9ine-disulfure isom\u00e9rase et confirm\u00e9 que la particule de reconnaissance du signal et la peptidase du signal sont confin\u00e9es dans la partie rugueuse du reticulum endoplasmique.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Amar-Costesec A The molecular organization of endoplasmic reticulum in liver: A plausible mode lo account for the enzymic heterogeneity<\/i> (1977)
\nAmar-Costesec A, Todd JA, Kreibich G Segregation of the Polypeptide Translocation Apparatus to Regions of the Endoplasmic Reticulum Containing Ribophorins and Ribosomes. I. Functional Tests on Rat Liver Microsomal Subfractions<\/i> (1984)
\nMarcantonio EE, Amar-Costesec A, Kreibich G Segregation of the Polypeptide Translocation Apparatus to Regions of the Endoplasmic Reticulum Containing Ribophorins and Ribosomes. II. Rat Liver Microsomal Subfractions Contain Equimolar Amounts of Ribophorins and Ribosomes<\/i> (1984)
\nAmar-Costesec A, Dublet B, Beaufay H Translocation and proteolytic processing of nascent secretory polypeptide chains: two functions associated with the ribosomal domain of the endoplasmic reticulum<\/i> (1989)
\nAmar-Costesec A, Hortsch M, Turu C A membrane preparation that contains proteins characteristic of the rough endoplasmic reticulum<\/i> (1988)<\/p>\n

Composition du domaine ribosomal du reticulum endoplasmique<\/b><\/span><\/h4>\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n
ARN<\/th>\naa lumen \/ aa total<\/th>\naa cytosol \/ aa total<\/th>\n<\/tr>\n
Ribophorin I<\/td>\n415 \/ 584<\/td>\n150 \/ 584<\/td>\n<\/tr>\n
Ribophorin II<\/td>\n516 \/ 632<\/td>\n70 \/ 632<\/td>\n<\/tr>\n
Sites de fixation des ribosomes<\/td>\n?<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
R\u00e9cepteur de la particule
\nde reconnaissance du signal<\/td>\n		<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Peptidase du signal<\/td>\n3<\/td>\n246\/323<\/td>\n<\/tr>\n
Sites de translocation des
\nProt\u00e9ines naissantes<\/td>\n		<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Prot\u00e9ine-disulfure isom\u00e9rase<\/td>\n<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n<\/table>\n

Pour expliquer l\u2019h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique du reticulum, une possibilit\u00e9 qui ne peut pas \u00eatre \u00e9cart\u00e9e sans v\u00e9rification exp\u00e9rimental serait qu\u2019il y a deux sortes de v\u00e9sicules microsomales d\u00e9rivant de deux r\u00e9seaux membranaires, l\u2019un portant les cha\u00eenes de transport d\u2019\u00e9lectrons du groupe b et l\u2019autre, la glucose 6-phosphatase et les enzymes du groupe c. Cette \u00ab hypoth\u00e8se de la multiplicit\u00e9 \u00bb fut \u00e9cart\u00e9e \u00e0 la lumi\u00e8re des r\u00e9sultats de cytochimie et d\u2019immuno-microscopie \u00e9lectronique avec marquage \u00e0 la ferritine : (i) Stanley Fowler et Jos\u00e9 Remacle montr\u00e8rent que des anticorps hybrides anti-cytochrome b5<\/sub><\/i>\u2013 anti-ferritine marqu\u00e9s \u00e0 la ferritine d\u00e9corent toutes les v\u00e9sicules microsomiales ; (ii) A. Leskes (The Rockefeller University, New York<\/i>), a montr\u00e9 que le d\u00e9p\u00f4t de phosphate de plomb produit par la r\u00e9action cytochimique de la glucose 6-phosphatase sur le glucose 6-phosphate est r\u00e9parti dans tout le reticulum ; (iii) Shiro Matsuura (Department of Physiology, Kansa\u00ef Medical University, Osaka<\/i>) a montr\u00e9 que des anticorps anti-cytochrome P-450 conjugu\u00e9s \u00e0 la ferritine d\u00e9corent toutes les v\u00e9sicules microsomiales ; (iv) Tsuneo Morimoto a montr\u00e9 que des anticorps anti-NADPH cytochrome c r\u00e9ductase conjugu\u00e9s \u00e0 la ferritine marquent la surface cytoplasmique de tout le r\u00e9ticulum endoplasmique. C\u2019est l\u2019\u00ab hypoth\u00e8se de l\u2019unicit\u00e9 \u00bb qui pr\u00e9vaut : il n\u2019y a qu\u2019un seul r\u00e9seau membranaire dans les h\u00e9patocytes. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Remacle J, Fowler S, Beaufay H, Amar-Costesec A, Berthet J Analytical Study of Microsomes and Isolated Subcellular Membranes from Rat Liver. V. electron microscope examination of microsomes for cytochrome b5 by means of a ferritin-labeled antibody<\/i> (1976)
\nLeskes A, Siekevitz P, Palade G Differentiation of endoplasmic reticulum in hepatocytes II. Glucose-6-phosphatase in Rough Microsomes<\/i> (1971)
\nMatsuura S, Fujii-Kuriyama Y, Tashiro Y Immunoelectron microscope localization of cytochrome P-450 on microsomes and other membrane structure<\/i> (1978)
\nMorimoto T, Matsuura S, Sazaki S, Tashiro Y, Omura T Immunochemical and immunoelectron microscope studies on the localization of NADPH-cytochrome c reductase<\/i> (1976) <\/p>\n

Les enzymes des groupes b et c appartiennent au m\u00eame syst\u00e8me membranaire mais d\u2019une mani\u00e8re telle que le rapport groupe c\/ groupe b augmente avec la charge en ribosomes. Si l\u2019on admet que le concept de fluidit\u00e9, propos\u00e9 en 1972 par Seymour Jonathan Singer et Garth L. Nicholson, s\u2019applique \u00e0 la membrane du reticulum endoplasmique, comment expliquer son h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique ? A-t-elle un support structurel ? <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Singer SJ, Nicholson GL The fluid mosaic model of the structure of cell membranes<\/i> (1972) <\/p>\n

Nous avons abord\u00e9 le probl\u00e8me de la topologie transverse (asym\u00e9trie transmembranaire) des enzymes du reticulum endoplasmique par une double approche exp\u00e9rimentale : (i) les tests de latence (accessibilit\u00e9 des enzymes aux substrats) ; un enzyme a son site actif orient\u00e9 \u00e0 l’int\u00e9rieur de la v\u00e9sicule si cet enzyme ne fonctionne que lorsqu’on d\u00e9truit la membrane (d\u00e9tergents, phospholipase, ultra-sons, cong\u00e9lation d\u00e9cong\u00e9lation) ; (ii) la sensibilit\u00e9 des v\u00e9sicules microsomales aux agents externes (enzymes prot\u00e9olytiques, anticorps, r\u00e9actifs chimiques non perm\u00e9ants). Les enzymes dont le site actif est expos\u00e9 sur la face externe (cytosolique) de la membrane sont inactiv\u00e9s. Dans le texte qui suit, j\u2019ai pris en compte les r\u00e9sultats publi\u00e9s par d\u2019autres groupes. Pour des raisons \u00e9videntes de concision je me contente d\u2019\u00e9num\u00e9rer les faits sans donner de justifications bibliographiques. Celles-ci sont accessibles dans l\u2019article que nous avons publi\u00e9, avec Henri Beaufay, dans le Journal of Theoretical Biology<\/i> 1981,89, 217-230. <\/p>\n

Composition enzymatique de la face cytosolique du domaine lisse
du reticulum endoplasmique<\/b><\/span><\/h4>\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n
NADH cytochrome b5 r\u00e9ductase
\n(la majeure partie)<\/td>\n		b<\/td>\n<\/tr>\n
cytochrome b5
\n(la majeure partie)<\/td>\n		<\/td>\n<\/tr>\n
NADPH cytochrome P-450 r\u00e9ductase\n<\/td>\nb<\/td>\n<\/tr>\n
cytochrome P-450\n<\/td>\n <\/td>\n<\/tr>\n
H\u00e8me oxyg\u00e9nase<\/td>\nb<\/td>\n<\/tr>\n
St\u00e9aroyl Co A d\u00e9saturase\n<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Hydroxym\u00e9thylglutaryl CoA r\u00e9ductase<\/td>\nb<\/td>\n<\/tr>\n
Cholesterol 7α-hydroxylase<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Acide lysophosphatidique acyl transferase<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
CoA-ligase des acides gras \u00e0 longue cha\u00eene<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Cholate-CoA ligase<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Phosphatidyl \u00e9thanolamine N-m\u00e9thyltransf\u00e9rase<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Diacylglyc\u00e9rol \u00e9thanolamine phosphotransf\u00e9rase<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Diacylglyc\u00e9rol choline phosphotransf\u00e9rase<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
Diacylglyc\u00e9rol acyltransf\u00e9rase <\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n
sn-glyc\u00e9rol-3-phosphate acyltransf\u00e9rase<\/td>\n<\/td>\n<\/tr>\n<\/table>\n

Les enzymes \u00e9num\u00e9r\u00e9s ci-dessus sont tous des prot\u00e9ines int\u00e9grales. Le cytochrome b5 est ancr\u00e9 dans la membrane par une segment proche de l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 carboxy-terminale ; la portion amino-terminale (80-90 r\u00e9sidus) contenant le groupe h\u00e8me \u00e9merge dans le cytosol ainsi que les acides amin\u00e9s charg\u00e9s de l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 carboxy-terminale. Les flavoprot\u00e9ines NADH-cytochrome b5 r\u00e9ductase et NADPH cytochrome P-450 r\u00e9ductase ont des domaines hydrophiles cytosoliques qui renferment les coenzymes : FAD pour la premi\u00e8re, FAD et FMN pour la seconde ; toutes deux comportent un domaine d\u2019ancrage hydrophobe. Les cytochromes P-450 forment une super-famille d\u2019h\u00e9moprot\u00e9ines qui agissent g\u00e9n\u00e9ralement comme oxydases finales d\u2019un syst\u00e8me de transport d\u2019\u00e9lectrons. Ils sont ins\u00e9r\u00e9s dans la face cytosolique de la membrane par leur extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale. L\u2019ancrage par h\u00e9lice α transmembranaire des enzymes du domaine lisse est variable : une h\u00e9lice pour l\u2019h\u00e8me oxyg\u00e9nase, 4 h\u00e9lices pour la st\u00e9aroyl-CoA d\u00e9saturase, 8 h\u00e9lices pour l\u2019HMG-CoA-r\u00e9ductase ; tous sont des prot\u00e9ines amphipatiques qui exposent leur site actif \u00e0 la face cytosolique de la membrane du reticulum endoplasmique. <\/p>\n

Composition enzymatique de la face luminale et du lumen du reticulum endoplasmique<\/b><\/span><\/h4>\n\n\n\n\n\n\n\n
Glucose 6-phosphatase<\/td>\nc<\/td>\n<\/tr>\n
est\u00e9rase<\/td>\nc<\/td>\n<\/tr>\n
Glucuronosyl transf\u00e9rase<\/td>\nc<\/td>\n<\/tr>\n
Prot\u00e9ine-disulfure isom\u00e9rase<\/td>\nc<\/td>\n<\/tr>\n
Nucl\u00e9oside diphosphatase<\/td>\nc<\/td>\n<\/tr>\n
Peptidase du signal<\/td>\nc<\/td>\n<\/tr>\n<\/table>\n

Les enzymes du groupe c sont ancr\u00e9s dans la face luminale de la membrane ou pr\u00e9sents dans le lumen. Les est\u00e9rases sont insensibles aux agents non perm\u00e9ants (prot\u00e9ases, anticorps) ; elles sont solubilis\u00e9es par rupture de la membrane des v\u00e9sicules (phospholipase, d\u00e9tergent, ultra-sons). La localisation luminale de la nucl\u00e9oside diphosphatase a \u00e9t\u00e9 d\u00e9montr\u00e9e par cytochimie et par son insensibilit\u00e9 aux agents non perm\u00e9ants (anticorps) ; elle est solubilis\u00e9e par rupture m\u00e9canique de la membrane, cong\u00e9lation-d\u00e9cong\u00e9lation, traitement aux d\u00e9tergents. La glucose 6-phosphatase est une hydrolase ins\u00e9r\u00e9e dans le demi feuillet luminal de la membrane ; le r\u00e9sultat des tests de latence indiquent que le site actif est orient\u00e9 vers le lumen ; le substrat (glucose 6-phosphate), g\u00e9n\u00e9r\u00e9 \u00e0 l\u2019ext\u00e9rieur du reticulum endoplasmique par la glucokinase, doit \u00eatre transport\u00e9 dans le lumen. C\u2019est le r\u00f4le de la prot\u00e9ine transmembranaire glucose 6-phosphate translocase, qui forme un complexe avec la glucose 6-phosphatase. L\u2019UDP glucuronosyl transf\u00e9rase poss\u00e8de une topologie semblable : insertion dans le demi feuillet luminal de la membrane ; l\u2019UDP-glucuronate \u2013 dont le groupe glucuronosyle est transf\u00e9r\u00e9 sur un accepteur \u2013 doit \u00eatre introduit dans le lumen par un transporteur transmembranaire. <\/p>\n

Si l\u2019on compare les donn\u00e9es \u00e9num\u00e9r\u00e9es ci-dessus \u00e0 celles sur le comportement des enzymes du reticulum endoplasmique en centrifugation isopycnique, on est conduit \u00e0 la conclusion que la distribution lat\u00e9rale des enzymes est en relation avec leur topologie transverse. L\u2019h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique organis\u00e9e de la face cytoplasmique de la membrane est reli\u00e9e \u00e0 des diff\u00e9rences structurelles pr\u00e9cises, comme la pr\u00e9sence ou l’absence de ribosomes. Les deux cha\u00eenes de transport d\u2019\u00e9lectrons sont exclues des zones o\u00f9 se trouvent les complexes supramol\u00e9culaires de ribosomes et de la machinerie de translocation des prot\u00e9ines \u00e0 travers la membrane, tandis que les enzymes de la face luminale ou du lumen se r\u00e9partissent dans tout le reticulum endoplasmique. Nous proposons donc de distinguer, sur la face cytoplasmique de la membrane, un domaine lisse et un domaine ribosomal. Quand on s\u00e9pare par centrifugation en gradient de densit\u00e9, des sous fractions microsomales, chacune contient une proportion d\u2019enzymes du domaine lisse inversement proportionnelle \u00e0 sa charge en ribosomes. La diff\u00e9rence de composition entre les fractions l\u00e9g\u00e8res (lisses) et les fractions lourdes charg\u00e9es en ribosomes (rugueuses) est quantitative et pas qualitative. Ces r\u00e9sultats nous ont conduit \u00e0 proposer une repr\u00e9sentation lat\u00e9rale en \u00ab peau de l\u00e9opard \u00bb pour la face cytosolique de la membrane du reticulum, avec des taches noires (domaine ribosomal) sur fond clair (domaine lisse des oxydor\u00e9ductases). <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Amar-Costesec A The molecular organization of endoplasmic reticulum in liver: A plausible model to account for the enzymic heterogeneity<\/i> (1977)
\nAmar-Costesec A, Beaufay H A structural basis of enzymic heterogeneity within liver endoplasmic reticulum<\/i> (1981)
\nBeaufay H, Amar-Costesec A, de Duve C The topology of enzymes in microsomes from liver<\/i> (1981) <\/p>\n

J\u2019ai propos\u00e9, en 1977, un mod\u00e8le structural pour rendre compte de l\u2019h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique du reticulum enzymatique ; ce mod\u00e8le a \u00e9t\u00e9 d\u00e9velopp\u00e9, d\u2019abord avec Henri Beaufay, puis avec Christian de Duve. Quelle est aujourd\u2019hui sa validit\u00e9 ? Je serai tent\u00e9 de dire qu\u2019aucune donn\u00e9e exp\u00e9rimentale nouvelle n\u2019est venue infirmer ce mod\u00e8le, au contraire. Comme le mod\u00e8le le pr\u00e9dit, les enzymes li\u00e9s \u00e0 la face cytosolique du domaine lisse du reticulum sont exclus des r\u00e9gions \u00e0 haute densit\u00e9 en ribosomes (domaine ribosomal). C\u2019est le cas des deux cha\u00eenes de transport d\u2019\u00e9lectrons ; c\u2019est aussi le cas des enzymes impliqu\u00e9s dans la synth\u00e8se des lipides \u2013 phospholipides, cholest\u00e9rol, c\u00e9ramides, st\u00e9ro\u00efdes – (domaine b), pr\u00e9sents dans les zones tubulaires \u00e0 fortes circonvolutions et exclus des citernes planes, aux parois membranaires rugueuses parall\u00e8les, et renfermant les complexes de traduction (translocons).<\/p>\n

Nos r\u00e9sultats exp\u00e9rimentaux montrent clairement que la distribution non-al\u00e9atoire des ribosomes sur la face cytoplasmique du reticulum est responsable de son h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique. La polarit\u00e9 mise en \u00e9vidence par Maurice Wibo et coll. – les v\u00e9sicules microsomales se distribuent en gradient de densit\u00e9 en fonction du nombre de ribosomes qu\u2019elles portent \u00e0 leur surface – est \u00e0 l\u2019origine de la diff\u00e9rence entre les enzymes des groupes b et c. Amar-Costesec et coll. ont montr\u00e9 que si l\u2019on centrifuge des v\u00e9sicules dont on a d\u00e9tach\u00e9 les ribosomes, les enzymes des deux groupes pr\u00e9sentent la m\u00eame distribution de densit\u00e9. Les enzymes li\u00e9s \u00e0 la face cytoplasmique du reticulum (groupe b) sont davantage exclus du domaine ribosomal que ceux li\u00e9s \u00e0 la face luminale ou libres dans le lumen (groupe c). La fixation des ribosomes \u00e0 la membrane met en jeu de nombreux constituants et des complexes prot\u00e9iques transmembranaires (ribophorines, translocon) ; la d\u00e9charge vectorielle dans le lumen des polypeptides n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9s implique une profonde r\u00e9organisation de la membrane. Il n\u2019est pas d\u00e9raisonnable de penser qu\u2019au sein des polysomes, les ribosomes li\u00e9s les uns aux autres par l\u2019ARNm qu\u2019ils transcrivent occupent une plus grande surface du c\u00f4t\u00e9 cytoplasmique. J\u2019avais suppos\u00e9, sans parvenir \u00e0 le d\u00e9montrer, que les aminoacyl-ARNt synth\u00e9tases pouvaient contribuer \u00e0 l\u2019occupation de la face cytoplasmique du domaine ribosomal. M. Mirande, Daniel Louvard et coll. avaient montr\u00e9 par une approche biochimique et immunocytologique que, dans les cellules NRK en culture, le marquage par des anticorps anti-aminoacyl-ARNt synth\u00e9tases a la m\u00eame la distribution intracellulaire que celui des anticorps anti-reticulum endoplasmique rugueux.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Wibo M, Amar-Costesec A, Berthet J, Beaufay H Electron Microscope Examination of Subcellular Fractions. III. Quantitative Analysis of the Microsomal Fraction Isolated from Rat Liver<\/i> (1971)
\nAmar-Costesec A, Wibo M, Thin\u00e8s-Sempoux D, Beaufay H, Berthet J Analytical Study of Microsomes and Isolated Subcellular Membranes from Rat Liver IV. Biochemical, Physical and Morphological Modifications of Microsomal Components Induced by Digitonin, EDTA and Pyrophosphate<\/i> (1974)
\nAmar-Costesec A, Turu C Subcellular topology of rat liver methionyl-, leucyl- and arginyl-tRNA synthetases<\/i> (1989)
\nMirande M, Le Corre D, Louvard D, Reggio H, Pailliez JP, Walter JP Association of an aminoacyl-tRNA synthetase complex and of phenylalanyl-tRNA synthetase with the cytoskeletal framework fraction from mammalian cells<\/i> (1985)<\/p>\n

A la lumi\u00e8re des travaux les plus r\u00e9cents, le r\u00e9ticulum endoplasmique appara\u00eet comme un organite dynamique h\u00e9t\u00e9rog\u00e8ne comportant une mosa\u00efque de domaines sp\u00e9cialis\u00e9s appel\u00e9s \u00ab Sites de contact membranaire \u00bb. dans le chapitre \u00ab Mitochondries \u00bb, j\u2019ai d\u00e9crit les Membranes associ\u00e9es aux Mitochondries (MAM, Mitochondria-Associated Membranes<\/i>) et leur \u00e9quipement enzymatique : (i) l’acyl-CoA:cholest\u00e9rol acyltransf\u00e9rase et la phosphatidyl \u00e9thanolamine N-m\u00e9thyltransf\u00e9rase, impliqu\u00e9es dans le transfert de lipides ; (ii) la machinerie de transfert du Ca2+<\/sup>, impliqu\u00e9e dans la signalisation calcique. Les MAM ne sont pas les seuls Sites de contact membranaire ; il existe aussi des sites de contact entre reticulum endoplasmique et membrane plasmique, reticulum endoplasmique et complexe de Golgi, reticulum endoplasmique et endosomes-lysosomes, avec chaque fois des concentrations d\u2019enzymes diff\u00e9rents.<\/p>\n

Le reticulum endoplasmique est l\u2019organite biosynth\u00e9tique par excellence de la cellule ; c\u2019est le lieu de synth\u00e8se des prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires, des prot\u00e9ines membranaires et luminales ; c\u2019est aussi le principal site de synth\u00e8se des lipides \u2013 phospholipides, cholest\u00e9rol, c\u00e9ramides. Il existe une \u00ab hom\u00e9ostasie prot\u00e9ique \u00bb, la \u00ab prot\u00e9ostasie \u00bb, qui est l’ensemble des m\u00e9canismes cellulaires r\u00e9gulant la synth\u00e8se, le repliement, le transport des prot\u00e9ines, et la d\u00e9gradation des prot\u00e9ines mal repli\u00e9es. Dans le lumen du reticulum endoplasmique, les foldases sont des chaperones qui consomment de l\u2019ATP pour catalyser la transition des polypeptides n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9s vers leur conformation native (structures secondaires et tertiaires) ; d\u2019autres chaperonnes assurent leur repliement tridimensionnel correct, \u00e9vitant ainsi la formation d\u2019agr\u00e9gats.<\/p>\n

Les g\u00e8nes du contr\u00f4le de qualit\u00e9 du reticulum endoplasmique ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9couverts par Randy Schekman (University of California, Berkeley<\/i>, Prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine 2013) au cours de ses travaux sur le transport v\u00e9siculaire chez la levure. En 1993, Stefan Jentsch (Friedrich Miescher Laboratorium, Max Planck Gesellschaft, T\u00fcbingen<\/i>) et Thomas Sommer ont utilis\u00e9 la g\u00e9n\u00e9tique de la levure pour montrer que des prot\u00e9ines mal repli\u00e9es peuvent \u00eatre expuls\u00e9es du reticulum endoplasmique dans le cytosol pour y \u00eatre d\u00e9grad\u00e9es par le syst\u00e8me cytosolique ubiquitine-prot\u00e9asome. C\u2019est ainsi que fut d\u00e9couverte et nomm\u00e9e la voie ERAD (Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation<\/i>) qui prot\u00e8ge les cellules contre l\u2019accumulation de prot\u00e9ines membranaires ou s\u00e9cr\u00e9toires mal repli\u00e9es ; elle les d\u00e9tecte, les intercepte et les d\u00e9truit.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Somer T, Jentsch S A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum<\/i> (1993)<\/p>\n

En cas de repliement incorrect (jusqu\u2019\u00e0 30% des prot\u00e9ines synth\u00e9tis\u00e9es), les chaperonnes tentent de restaurer le repliement correct. Ce n\u2019est qu\u2019en cas d\u2019\u00e9chec que la prot\u00e9ine est expuls\u00e9e hors du lumen vers le prot\u00e9asome cytosolique. On a montr\u00e9 que les enzymes de contr\u00f4le qualit\u00e9 et de d\u00e9gradation ne sont pas r\u00e9partis uniform\u00e9ment dans le lumen mais regroup\u00e9s dans des microdomaines de la membrane lisse \u00e0 proximit\u00e9 des prot\u00e9asomes. La voie ERAD proc\u00e8de par \u00e9tapes : dans le lumen du reticulum endoplasmique, les prot\u00e9ines mal form\u00e9es sont identifi\u00e9es par des chaperonnes puis expuls\u00e9es dans le cytosol (r\u00e9tro-translocation) ; elles sont marqu\u00e9es par la liaison covalente de mol\u00e9cules d\u2019ubiquitine (le baiser de la mort) catalys\u00e9e par un enzyme int\u00e9gral membranaire du reticulum, dont le site catalytique est orient\u00e9 vers le cytosol. Le prot\u00e9asome d\u00e9grade la prot\u00e9ine ubiquitinyl\u00e9e en acides amin\u00e9s.<\/p>\n

Emmanuel J. Wiertz, Hidde L. Ploegh et coll. (Boston Children\u2019s Hospital<\/i>) ont montr\u00e9 que la voie ERAD utilise le complexe Sec61 d\u2019importation des prot\u00e9ines dans le reticulum pour le transport r\u00e9trograde des prot\u00e9ines membranaires mal form\u00e9e vers le cytosol (r\u00e9tro-translocation) o\u00f9 elles sont d\u00e9grad\u00e9es par le prot\u00e9asome. Une prot\u00e9ine cod\u00e9e par le cytom\u00e9galovirus humain, provoque le transfert de mol\u00e9cules du complexe majeur d\u2019histocompatibilit\u00e9 de classe I \u00e0 travers le canal Sec61, dans le cytosol. Les r\u00e9sultats de ce travail ont confirm\u00e9 que le complexe Sec61 est un pore bidirectionnel qui joue un r\u00f4le central dans la voie ERAD.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Wiertz EJ, Tortorella D, Bogyo M, Yu J, Mothes W, Jones TR, Rapoport TA, Ploegh HL Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction<\/i> (1996)
\nWiertz EJ, Jones TR, Sun L, Bogyo M, Geuze HJ, Ploegh HL The human cytomegalovirus US11 gene product dislocates MHC class I heavy chains from the endoplasmic reticulum to the cytosol<\/i> (1996)<\/p>\n

Article de revue : Guerriero CJ, Brodsky JL The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology<\/i> (2012)<\/p>\n

<\/a>Oxyg\u00e9nases microsomiales<\/b><\/span><\/h3>\n

Tr\u00e8s t\u00f4t apr\u00e8s leur d\u00e9couverte, les microsomes furent associ\u00e9s \u00e0 la synth\u00e8se prot\u00e9ique ; au fil des ann\u00e9es, il devint \u00e9vident que les composants de cette fraction subcellulaire sont des acteurs d\u2019une vari\u00e9t\u00e9 de voies m\u00e9taboliques ; plusieurs centaines d\u2019enzymes microsomiaux ont \u00e9t\u00e9 r\u00e9pertori\u00e9s. Le composant principal des microsomes, le reticulum endoplasmique est impliqu\u00e9 dans la m\u00e9tabolisation et l\u2019\u00e9limination des \u00ab x\u00e9nobiotiques \u00bb. Ce processus vital est conserv\u00e9, sous une forme plus ou moins \u00e9labor\u00e9e, dans pratiquement toutes les cellules procaryotes et eucaryotes, des bact\u00e9ries aux mammif\u00e8res. On d\u00e9signe sous le nom de x\u00e9nobiotique toute substance \u00e9trang\u00e8re \u00e0 l\u2019organisme, introduite volontairement ou accidentellement dans l\u2019organisme, par voie orale, pulmonaire ou cutan\u00e9e : polluants atmosph\u00e9riques, colorants, additifs alimentaires, substances m\u00e9dicamenteuses, hydrocarbures polycycliques canc\u00e9rig\u00e8nes, pesticides\u2026 La plupart de ces mol\u00e9cules ont un caract\u00e8re hydrophobe. En l\u2019absence d\u2019un m\u00e9canisme physiologique d\u2019\u00e9limination efficace, ces substances s\u2019accumulent dans les tissus adipeux de l\u2019organisme, ce qui explique leur dangerosit\u00e9 pour la sant\u00e9 (malformations, cancers). Apr\u00e8s la Seconde Guerre mondiale, des taux anormalement \u00e9lev\u00e9s d\u2019un pesticide largement utilis\u00e9 \u00e0 l\u2019\u00e9poque, le dichlorodiph\u00e9nyltrichloro\u00e9thane (DDT) ont \u00e9t\u00e9 retrouv\u00e9s dans le syst\u00e8me nerveux central de patients d\u00e9c\u00e9d\u00e9s.<\/p>\n

En 1962, la parution de l\u2019ouvrage \u00ab Silent Spring<\/i> \u00bb provoqua un \u00e9lectrochoc dans la conscience collective mondiale. La biologiste marine Rachel Carson y d\u00e9non\u00e7ait les cons\u00e9quences d\u00e9vastatrices de l’utilisation massive de pesticides synth\u00e9tiques ; s\u2019il est vrai qu\u2019ils d\u00e9truisent les insectes nuisibles pour les r\u00e9coltes, ils remontent aussi la cha\u00eene alimentaire et s\u2019attaquent aux populations d\u2019oiseaux (ainsi qu\u2019aux mammif\u00e8res et \u00e0 l\u2019homme). Cette d\u00e9nonciation provoqua une temp\u00eate m\u00e9diatique et politique qui remonta jusqu\u2019\u00e0 la pr\u00e9sidence des \u00c9tats-Unis (John Fitzgerald Kennedy). Carson fit l\u2019objet d\u2019une intense campagne de d\u00e9nigrement orchestr\u00e9e par les g\u00e9ants de la chimie, mettant en doute ses comp\u00e9tences professionnelles et sa sant\u00e9 mentale. Mais rien ne pouvait plus arr\u00eater la d\u00e9ferlante qui donna naissance au mouvement \u00e9cologiste, amena des restrictions s\u00e9v\u00e8res \u00e0 l\u2019emploi du DDT, puis \u00e0 l\u2019interdiction totale de son usage en 1972.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Carson R Silent Spring<\/i> (1962)<\/p>\n

Note : Rachel Carson n\u2019a jamais connu le succ\u00e8s mondial de son ouvrage ; elle est d\u00e9c\u00e9d\u00e9e deux ans apr\u00e8s sa parution, \u00e0 l\u2019\u00e2ge de 57 ans.<\/p>\n

Gerald C. Mueller, dans le laboratoire de James A. Miller et d\u2019Elizabeth C. Miller (McArdle Memorial Laboratory, The University of Wisconsin<\/i>), d\u00e9couvrit que le foie joue un r\u00f4le dans le m\u00e9tabolisme du DAB (N,N-Dim\u00e9thyl-4-AminoazoBenz\u00e8ne). On soup\u00e7onnait ce colorant aminoazo\u00efque de se lier \u00e0 des prot\u00e9ines cellulaire et d\u2019\u00eatre canc\u00e9rig\u00e8ne, alors qu\u2019\u00e0 l\u2019\u00e9poque il \u00e9tait utilis\u00e9 dans l\u2019alimentation sous le nom de \u00ab jaune de beurre \u00bb ! Mueller et Miller montr\u00e8rent qu\u2019une fraction particulaire, pr\u00e9par\u00e9e \u00e0 partir d\u2019un homog\u00e9nat de foie de rat, catalyse la N-d\u00e9m\u00e9thylation (l\u2019enl\u00e8vement d\u2019un groupe m\u00e9thyle CH3- li\u00e9 \u00e0 un atome d\u2019azote) du DAB en pr\u00e9sence d\u2019oxyg\u00e8ne et d\u2019un nucl\u00e9otide pyridinique r\u00e9duit, le NADPH. Dans les ann\u00e9es 1950, Julius Axelrod, avec Bernard B. Brodie (Goldwater Memorial Hospital, New York<\/i>), \u00e9lucida le m\u00e9canisme physiologique de transformation de l\u2019ac\u00e9tanilide en aniline. L\u2019ac\u00e9tanilide, pr\u00e9sent dans un m\u00e9dicament tr\u00e8s populaire, le Bromo Seltzer, prescrit aux patients souffrant de br\u00fblures gastriques, provoquait une m\u00e9th\u00e9moglobin\u00e9mie ; la m\u00e9th\u00e9moglobine est un produit d\u2019oxydation de l\u2019h\u00e9moglobine dont l\u2019atome de fer ferreux (Fe2+<\/sup>) a \u00e9t\u00e9 transform\u00e9 en fer ferrique (Fe3+<\/sup>). Axelrod est surtout connu pour ses travaux sur les neurotransmetteurs de la famille des cat\u00e9cholamines, comme l\u2019adr\u00e9naline ou la noradr\u00e9naline, travaux pour lesquels il re\u00e7ut le prix Nobel m\u00e9decine ou physiologie 1970. Il avait commenc\u00e9 sa carri\u00e8re comme postier avant de devenir technicien de laboratoire. Il s\u2019int\u00e9ressa aussi au m\u00e9tabolisme d\u2019agents psychotropes : amph\u00e9tamines et \u00e9ph\u00e9drine et caract\u00e9risa les trois ingr\u00e9dients indispensables \u00e0 leur transformation : microsomes, TPNH et oxyg\u00e8ne.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Mueller GC, Miller JA The reductive cleavage of 4-dimethylaminoazobenzene by rat liver: The intracellular distribution of the enzyme system and its requirement for triphosphopyridine nucleotide<\/i> (1949)
\nBrodie BB, Axelrod J The estimation of acetanilide and its metabolic products, aniline, N-acetyl p-aminophenol and p-amino-phenol, free and total conjugated, in biological fluids and tissues<\/i> (1948)<\/p>\n

L\u2019existence d\u2019un syst\u00e8me microsomal de transport d\u2019\u00e9lectrons fut mise en \u00e9vidence par Kenneh J. Ryan et Lewis Engel (Department of Biological Chemistry, Harvard Medical School, Boston<\/i>) ; ils montr\u00e8rent que les microsomes de la glande corticosurr\u00e9nale de b\u0153uf renferment un enzyme qui catalyse l\u2019hydroxylation en C21 de la progest\u00e9rone. La r\u00e9action s\u2019accomplit en pr\u00e9sence de TPNH (NADPH) et du surnageant \u00e0 haute vitesse ; elle est inhib\u00e9e par le monoxyde de carbone CO. Cette 21-hydroxylase est une h\u00e9moprot\u00e9ine qui joue un r\u00f4le essentiel dans la biosynth\u00e8se de l\u2019hormone min\u00e9ralocortico\u00efde \u2013 l\u2019aldost\u00e9rone \u2013 et du cortisol.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Ryan KJ, Engel LL Hydroxylation of steroids at carbon 21<\/i> (1957)<\/p>\n

En 1958, dans le laboratoire de Britton Chance (Eldridge Reeves Johnson Foundation, University of Pennsylvania<\/i>), le physico chimiste Martin Klingenberg et un \u00e9tudiant postdoctoral, David Garfinkel (Harvard University<\/i>), identifi\u00e8rent dans les microsomes de foie de rat et de porc un pigment liant le monoxyde de carbone (CO).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Klingenberg M Pigments of rat liver microsomes<\/i> (1958)
\nGarfinkel D Studies on pig liver microsomes. I. Enzymic and pigment composition of different microsomal fractions<\/i> (1958)<\/p>\n

En 1962, Tsuneo Omura et Ryo Sato (Osaka University Institute for Protein Research<\/i>) d\u00e9couvrirent que les microsomes de foie de rat contiennent un cytochrome d\u2019un type un nouveau, diff\u00e9rent du cytochrome b5. En pr\u00e9sence de monoxyde de carbone CO, ce cytochrome pr\u00e9sente un pic d\u2019absorption \u00e0 450 nm. En 1964, Omura et Sato montr\u00e8rent que ce pigment, abondant dans les microsomes, est une h\u00e9moprot\u00e9ine avec un h\u00e8me de type b, et d\u00e9crivirent les conditions de sa solubilisation et de sa purification. Ils propos\u00e8rent de l\u2019appeler cytochrome P450. Ce nom fut adopt\u00e9 malgr\u00e9 sa non-conformit\u00e9 avec la nomenclature des cytochromes et leur classement en quatre groupes : a<\/i>, b<\/i>, c<\/i> et d<\/i>, selon la nature de l\u2019h\u00e8me du groupement prosth\u00e9tique.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Omura T, Sato R A new cytochrome in liver microsomes<\/i> (1962)
\nOmura T, Sato R The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature<\/i> (1964)<\/p>\n

Ronald W. Estabrook (University of Texas Southwestern Medical Center<\/i>) d\u00e9montra l\u2019implication du nouveau cytochrome dans la r\u00e9action \u00e9tudi\u00e9e par Ryan et Engel. Estabrook et coll. ont montr\u00e9 que l\u2019inhibition de la 21-hydroxylation des st\u00e9ro\u00efdes par le CO est supprim\u00e9e lorsqu\u2019on illumine le milieu r\u00e9actionnel \u00e0 une longueur d’onde de 450 nm. Le CO avait pris la place de l’O2<\/sub> sur le site actif de l’enzyme. Cooper et coll. \u00e9tablirent la stoechiom\u00e9trie de la r\u00e9action :<\/p>\n

st\u00e9ro\u00efde + NADPH + O2<\/sub> ➔ hydroxyst\u00e9ro\u00efde + NADP+<\/sup> + H2<\/sub>O<\/p>\n

L\u2019enzyme catalysant la conversion d\u2019une mol\u00e9cule de 17-hydroxyprogest\u00e9rone en 11-d\u00e9soxycortisol, en consommant une mol\u00e9cule de NADPH et une mol\u00e9cule d’O2<\/sub>, est une oxydase \u00e0 fonction mixte. Cette d\u00e9nomination a \u00e9t\u00e9 propos\u00e9e en 1957 par Howard Mason. Les oxydases utilisent l’O2 comme accepteur d’\u00e9lectrons avec formation d\u2019une mol\u00e9cule d’H2<\/sub>O ou d\u2019H2<\/sub>O2<\/sub>, sans incorporer l’O2<\/sub> dans le substrat. Les oxydases \u00e0 fonction mixte incorporent un atome de la mol\u00e9cule d’O2<\/sub> dans le substrat et r\u00e9duisent l’autre atome en H2<\/sub>O. Aujourd\u2019hui, les enzymes de ce type (il s\u2019agit de cytochromes P-450) sont d\u00e9sign\u00e9s par le terme \u00ab monooxyg\u00e9nases \u00bb, en conformit\u00e9 avec la nomenclature internationale. Le terme \u00ab oxyg\u00e9nase \u00bb a \u00e9t\u00e9 cr\u00e9\u00e9, en 1955, par Osamu Hayaishi (National Institute of Arthritis and Metabolic Diseases, Bethesda<\/i>) pour d\u00e9signer les enzymes – dioxyg\u00e9nases – qui transf\u00e8rent les deux atomes de l’O2<\/sub> dans le substrat.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Estabrook RW, Cooper DY, Rosenthal O The light reversible carbon monoxide inhibition of the steroid C21-hydroxylase system of the adrenal cortex<\/i> (1963)
\nCooper DY, Estabrook RW, Rosenthal O The Stoichiometry of Steroid C21-Hydroxylation by Adrenal Cortex Microsomes<\/i> (1963)
\nMason HS Mechanisms of oxygen metabolism<\/i> (1957)
\nHayaishi O, Katagiri M, Rothberg S Mechanism of the Pyrocatechase Reaction<\/i> (1955)<\/p>\n

Les flavoprot\u00e9ines sont des transporteurs d\u2019\u00e9lectrons contenant un ou deux coenzymes dont la structure est apparent\u00e9e \u00e0 celle de la riboflavine (vitamine B2) ; elles transf\u00e8rent g\u00e9n\u00e9ralement des \u00e9lectrons \u00e0 des cytochromes. La pr\u00e9sence de flavoprot\u00e9ines dans les microsomes avait \u00e9t\u00e9 d\u00e9montr\u00e9e par George Hogeboom (National Institute of Health, Bethesda<\/i>) en 1949 : par centrifugation diff\u00e9rentielle d\u2019homog\u00e9nats de foie de rat ou de souris, et d\u2019h\u00e9patome murin, il avait \u00e9tabli qu\u2019une flavoprot\u00e9ine, la DPNH cytochrome c<\/i> r\u00e9ductase, s\u00e9dimente pr\u00e9f\u00e9rentiellement dans la fraction microsomale plut\u00f4t que dans la fraction mitochondriale. Hogeboom, pionnier de la localisation subcellulaire des enzymes par centrifugation diff\u00e9rentielle, \u00e9tait un ancien collaborateur d\u2019Albert Claude au Rockefeller Institute<\/i>. La m\u00eame ann\u00e9e, Bernard L. Horecker (National Institute of Health, Bethesda<\/i>), le d\u00e9couvreur de la voie des pentoses phosphate, caract\u00e9risa une TPNH cytochrome c<\/i> r\u00e9ductase. Hogeboom et Walter Schneider montr\u00e8rent que la de TPNH cytochrome c<\/i> r\u00e9ductase est pr\u00e9sente dans les microsomes en proportion plus \u00e9lev\u00e9e que la DPNH cytochrome c<\/i> r\u00e9ductase.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Hogeboom GH Cytochemical studies of mammalian tissues. II. The distribution of diphosphopyridine nucleotide-cytochrome c reductase in rat liver fractions<\/i> (1949)
\nHorecker BL, Heppel LA The reduction of cytochrome c by xanthine oxidase<\/i> (1949)
\nHogeboom GH, Schneider WC Cytochemical studies of mammalian tissues. III. Isocitric dehydrogenase and triphosphopyridine nucleotide-cytochrome c reductase of mouse liver<\/i> (1950)<\/p>\n

Apr\u00e8s la d\u00e9monstration que les microsomes contiennent des flavoprot\u00e9ines, ce fut aussi le cas pour les cytochromes : Charles F. Strittmatter et Eric G. Ball (Department of Biological Chemistry, Harvard Medical School, Boston<\/i>) rapport\u00e8rent la pr\u00e9sence d\u2019une h\u00e9moprot\u00e9ine, le cytochrome m, dans les microsomes h\u00e9patiques ; ce cytochrome avait \u00e9t\u00e9 identifi\u00e9 par David Keilin et E.F. Hartree (Molteno Institute, University of Cambridge<\/i>) en 1940, et appel\u00e9 cytochrome b<\/i>1<\/sub>. Alwyn M. Pappenheimer et Carroll M. Williams (Department of Bacteriology, New York University School of Medicine<\/i>) le baptis\u00e8rent cytochrome b<\/i>5<\/sub>. En 1956, Philipp Strittmatter et Sidney F. Velick (Department of Biological Chemistry, Washington University School of Medicine, St. Louis<\/i>) isol\u00e8rent \u00e0 partir de foie de lapin un enzyme catalysant le transfert d\u2019\u00e9lectrons du diphosphopyridine nucl\u00e9otide r\u00e9duit (DPNH, NADH) \u00e0 un cytochrome microsomial, puis au cytochrome c<\/i>. Les pi\u00e8ces du puzzle s\u2019assembl\u00e8rent : il existe, dans les microsomes, deux cha\u00eenes de transport d\u2019\u00e9lectrons compos\u00e9es chacune d\u2019une flavoprot\u00e9ine r\u00e9ductase et de cytochromes. La NADH : cytochrome b<\/i>5<\/sub> oxydor\u00e9ductase utilise le FAD comme cofacteur et catalyse la r\u00e9action :<\/p>\n

2 ferricytochrome b<\/i>5<\/sub> + NADH ↔ 2 ferrocytochrome b<\/i>5<\/sub> + NAD+<\/sup> + H+<\/sup><\/p>\n

La NADPH : cytochrome P450 r\u00e9ductase catalyse la r\u00e9action :<\/p>\n

n<\/i> h\u00e9moprot\u00e9ine ox + NADPH + H+<\/sup> ↔ n<\/i> h\u00e9moprot\u00e9ine red + NADP+<\/sup><\/p>\n

Le trajet suivi par les \u00e9lectrons est le suivant :<\/p>\n

NADPH → FAD → FMN → P450 → O2<\/sub><\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Strittmatter CF, Ball EG A Hemochromogen Component of Liver Microsomes<\/i> (1952)
\nKeilin D, Hartree F Succinic dehydrogenase-cytochrome system of cells<\/i> (1940)
\nPappenheimer AM, Williams CM Cytochrome b5<\/sub> and the dihydro-coenzyme I-oxidase system in the cecropia silkworm<\/i> (1954)
\nStrittmatter P, Velick SF A Microsomal Cytochrome Reductase Specific for Diphosphopyridine Nucleotide<\/i> (1955)<\/p>\n

La cytochrome P-450 r\u00e9ductase fournit des \u00e9lectrons \u00e0 quatre voies m\u00e9taboliques : (i) celle des cytochromes P450, une superfamille d\u2019h\u00e9moprot\u00e9ines comprenant plus de deux mille membres impliqu\u00e9s dans le m\u00e9tabolisme des x\u00e9nobiotiques (contaminants et canc\u00e9rig\u00e8nes chimiques, pesticides) et des m\u00e9dicaments, et dans la synth\u00e8se d\u2019endobiotiques (st\u00e9rols, acides biliaires) ; (ii) celle du cytochrome b<\/i>5<\/sub> et des d\u00e9saturases et \u00e9longases impliqu\u00e9es dans la transformation des acides gras ; (iii) aux enzymes de la biosynth\u00e8se des st\u00e9rols (7 d\u00e9hydrocholest\u00e9rol r\u00e9ductase, squal\u00e8ne mono-oxyg\u00e9nase, cytochrome b<\/i>5<\/sub>) ; (iv) celle de l\u2019h\u00e8me oxyg\u00e9nase, qui catalyse les \u00e9tapes finale du catabolisme de l\u2019h\u00e8me chez les mammif\u00e8res. Le catabolisme des x\u00e9nobiotiques comporte deux phases : au cours de la phase I (phase d\u2019oxydation), des substrats hydrophobes sont transform\u00e9s en mol\u00e9cules polaires par les mono-oxyg\u00e9nases ; au cours de la phase II (phase de conjugaison) les produits d\u2019oxydation sont conjugu\u00e9s par une liaison covalente \u00e0 des mol\u00e9cules facilitant leur excr\u00e9tion par le rein. On classe parmi les enzymes de la phase I l\u2019\u00e9poxyde hydrolase (les \u00e9poxydes sont des mol\u00e9cules tr\u00e8s r\u00e9actives susceptibles d\u2019endommager les constituants cellulaires comme les acides nucl\u00e9iques). Parmi les enzymes de la phase II, on trouve l\u2019UDP-glucuronosyl transf\u00e9rase qui conjugue la bilirubine \u00e0 une mol\u00e9cule d\u2019acide glucuronique. La bilirubine est un m\u00e9tabolite naturel, mais son accumulation dans l\u2019organisme a des effets n\u00e9fastes (jaunisse). La d\u00e9ficience en bilirubine glucuronosyltransf\u00e9rase est \u00e0 l\u2019origine de la maladie de Gilbert (d\u00e9ficit partiel) ou de la maladie de Crigler-Najjar (d\u00e9ficit total), une maladie tr\u00e8s rare \u00e0 transmission autosomique r\u00e9cessive. Un autre enzyme de la phase II, la sulfotransf\u00e9rase, catalyse le transfert d\u2019un groupe sulfate sur un groupe alcool ou amin\u00e9 d\u2019un accepteur (un st\u00e9ro\u00efde, par exemple). Le donneur de sulfate est le 3\u2019-phosphoad\u00e9nosine 5\u2019-phosphosulfate (PAPS).<\/p>\n

Il existe une forme \u00ab soluble \u00bb de la NADH cytochrome b<\/i>5<\/sub> r\u00e9ductase dans les h\u00e9maties : la NADH m\u00e9th\u00e9moglobine r\u00e9ductase, qui catalyse la r\u00e9duction de la m\u00e9th\u00e9moglobine ; ce produit d\u2019oxydation de l\u2019h\u00e9moglobine est incapable de fixer l\u2019oxyg\u00e8ne pour le transporter vers les tissus. La m\u00e9th\u00e9moglobin\u00e9mie h\u00e9r\u00e9ditaire est une pathologie provoqu\u00e9e par la d\u00e9ficience g\u00e9n\u00e9tique (autosomique r\u00e9cessive) en NADH cytochrome b<\/i>5<\/sub>r\u00e9ductase. Cette maladie g\u00e9n\u00e9tique rare affecte les globules rouges et se traduit, \u00e0 la naissance, par une cyanose par d\u00e9ficit du transport de l\u2019oxyg\u00e8ne.<\/p>\n

La st\u00e9aroyl CoA d\u00e9saturase (\u0394-9 d\u00e9saturase) est une oxydor\u00e9ductase microsomiale qui transforme l\u2019acide st\u00e9arique \u2013 un acide gras satur\u00e9 \u2013 en acide ol\u00e9ique. La st\u00e9aroyl CoA d\u00e9saturase re\u00e7oit ses \u00e9lectrons du cytochrome b<\/i>5<\/sub> et introduit une double liaison dans la cha\u00eene aliphatique de l\u2019acide st\u00e9arique. Cette r\u00e9action de d\u00e9saturation en C9-C10 est une \u00e9tape limitante de la biosynth\u00e8se des acides gras insatur\u00e9s, une des fonctions importantes du reticulum endoplasmique. Le r\u00f4le de la st\u00e9aroyl CoA d\u00e9saturase comme r\u00e9gulateur du m\u00e9tabolisme et son r\u00f4le dans l\u2019apparition du \u00ab syndrome m\u00e9tabolique \u00bb, dont l\u2019ob\u00e9sit\u00e9 est une manifestation pr\u00e9occupante, a \u00e9t\u00e9 longtemps m\u00e9connue.<\/p>\n

<\/a>Fonctions du reticulum endoplasmique des h\u00e9patocytes<\/b><\/span><\/h3>\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n
Synth\u00e8se et maturation des prot\u00e9ines (du reticulum endoplasmique, des lysosomes, du complexe de Golgi, de la membrane plasmique, et des prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires); repliement et modifications post-traductionnelles<\/th>\n<\/tr>\n
R\u00e9cepteur de la particule de reconnaissance du signal; complexe de translocation (translocon, Sec61); peptidase du signal; chaperones Bip, GRP (Glucose-regulated protein); prot\u00e9ine disulfure isom\u00e9rase; prot\u00e9ine de choc thermique 70 kDa 5; calnexine; calr\u00e9ticuline; ERp57 (Endoplasmic Reticulum protein 57kDa); peptidyl-prolyl cis\/trans isom\u00e9rase<\/td>\n<\/tr>\n
Biosynth\u00e8se et modifications des cha\u00eenes oligosaccharidiques et glycosylation des prot\u00e9ines<\/th>\n<\/tr>\n
N-ac\u00e9tylglucosamine-phosphotransf\u00e9rase ; N-ac\u00e9tylglucosamine-transf\u00e9rase ; mannosyl-transf\u00e9rase ; glucosyl-transf\u00e9rase ; Oligosaccharyl-tranf\u00e9rase (ribophorines I et II)<\/td>\n<\/tr>\n
glucosidase II; mannosidases<\/td>\n<\/tr>\n
Biosynth\u00e8se et m\u00e9tabolisme des lipides, des glyc\u00e9rophospholipides, et du plasmalog\u00e8ne<\/th>\n<\/tr>\n
NADH cytochrome b5 r\u00e9ductase (d\u00e9saturation et \u00e9longation des acides gras), glyc\u00e9rophosphate (dihydroxyac\u00e9tone phosphate) acyltransf\u00e9rase ; acide lysophosphatidique acyltransf\u00e9rase<\/td>\n<\/tr>\n
Biosynth\u00e8se des st\u00e9ro\u00efdes<\/th>\n<\/tr>\n
st\u00e9ro\u00efde aromatase (\u0153strog\u00e8ne synthase)\u2026<\/td>\n<\/tr>\n
M\u00e9tabolisme du glycog\u00e8ne<\/th>\n<\/tr>\n
Glucose 6-phosphatase ; transporteur du glucose 6-phosphate (T1) ; transporteur du glucose (T2) ; transporteur du phosphate (T3)<\/td>\n<\/tr>\n
D\u00e9toxification ; M\u00e9tabolisme des m\u00e9dicaments, des vitamines liposolubles, des x\u00e9nobiotiques et des acides gras polyinsatur\u00e9s<\/th>\n<\/tr>\n
NADPH cytochrome P-450 r\u00e9ductase; cytochromes P-450<\/td>\n<\/tr>\n
NADH cytochrome b5 r\u00e9ductase<\/td>\n<\/tr>\n
Catabolisme de l\u2019h\u00e9moglobine<\/th>\n<\/tr>\n
H\u00e8me oxyg\u00e9nase<\/td>\n<\/tr>\n
M\u00e9tabolisme de la bilirubine<\/th>\n<\/tr>\n
UDP glucuronosyltransf\u00e9rase<\/td>\n<\/tr>\n
Stockage et signalisation du Ca2+<\/sup><\/th>\n<\/tr>\n
R\u00e9cepteur de l\u2019inositol triphosphate<\/td>\n<\/tr>\n
R\u00e9gulation des ions Ca2+<\/sup> et transport membranaire<\/th>\n<\/tr>\n
Carboxylest\u00e9rases (hydrolases A et B)<\/td>\n<\/tr>\n<\/table>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

\u00ab Small Granules \u00bb \u00ab In biology, as in mechanics, one of the best ways to figure out how something works is to break it. \u00bb Gretchen Vogel La r\u00e9vocation de l\u2019Edit de Nantes par Louis XIV, en 1685, provoqua un exode massif des Huguenots fran\u00e7ais, dont certains choisirent de s\u2019\u00e9tablir dans les colonies anglaises d\u2019Am\u00e9rique du nord ; parmi eux … Continue reading Chapitre 6<\/span> →<\/span><\/a><\/p>\n","protected":false},"author":3,"featured_media":0,"parent":0,"menu_order":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_monsterinsights_skip_tracking":false,"footnotes":""},"class_list":["post-3413","page","type-page","status-publish","hentry"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/3413","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/users\/3"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=3413"}],"version-history":[{"count":15,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/3413\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":18007,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/3413\/revisions\/18007"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=3413"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}