{"id":3693,"date":"2014-03-19T13:00:01","date_gmt":"2014-03-19T12:00:01","guid":{"rendered":"http:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/?page_id=3693"},"modified":"2025-03-24T15:19:55","modified_gmt":"2025-03-24T14:19:55","slug":"chapitre-7","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/chapitre-7\/","title":{"rendered":"Chapitre 7"},"content":{"rendered":"

<\/a>Complexe de Golgi<\/b><\/span><\/h2>\n

\u00ab No cellular organelle has been the subject of as many, as long-lasting, or as diverse polemics as the Golgi apparatus. \u00bb <\/i><\/p>\n

William Gordon Whaley <\/i><\/p>\n

<\/a>Une existence controvers\u00e9e<\/b><\/span><\/h3>\n

En 1865, Adolph J.H.F. von La Valette-Saint George, professeur d\u2019anatomie \u00e0 l\u2019Universit\u00e9 de Bonn, d\u00e9crit le Nebenk\u00f6rper<\/i> (l\u2019appareil de Golgi ?) dans les cellules sexuelles de l\u2019escargot ; il observe son \u00e9volution au cours de la mitose et d\u00e9crit sa reformation post-mitotique \u00e0 partir d\u2019une masse granulaire cytoplasmique. En 1896, Bartolomeo Camillo Emilio Golgi (Universit\u00e9 de Pavie) cherche \u00e0 mettre au point une technique de coloration du tissu nerveux ; essayant diverses m\u00e9thodes d\u2019impr\u00e9gnation m\u00e9tallique, il d\u00e9crit la \u00ab reazione nera<\/i> \u00bb : les cellules nerveuses \u2013 axones et dendrites \u2013 sont color\u00e9es en noir par le nitrate d\u2019argent. En 1898, dans des coupes de tissu nerveux de hibou et de chat, il d\u00e9couvre, \u00e0 proximit\u00e9 du noyau et du centrosome, un \u00ab apparato reticolare interno<\/i> \u00bb. En 1902, l\u2019anatomiste Friedrich Kopsch am\u00e9liore la technique de coloration de Golgi en introduisant une impr\u00e9gnation \u00e0 l\u2019acide osmique (coloration mixte \u00e0 l\u2019osmium et au nitrate d\u2019argent). L\u2019appareil r\u00e9ticulaire interne est rebaptis\u00e9 \u00ab appareil de Golgi \u00bb en 1909, puis \u00ab complexe de Golgi \u00bb. Camillo Golgi et Santiago Ramon y Cajal (Universit\u00e9 de Barcelone) partag\u00e8rent le prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine 1906 pour avoir caract\u00e9ris\u00e9 le quatuor de cellules de la neuroglie : astrocytes, oligodendrocytes, cellules microgliales et cellules \u00e9pendymaires. La d\u00e9couverte d\u2019un nouvel organite, le complexe de Golgi, passa inaper\u00e7ue. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Von La Valette-Saint George AJHF Ueber die Genese der Samenk\u00f6rper <\/i> (1865)
\nGolgi C Sulla struttura delle cellule nervose dei gangli spinali<\/i> (1898) <\/span><\/p>\n

Dans la citation cit\u00e9e en exergue, William G. Whaley rappelle que peu d\u2019organites ont fait l\u2019objet d\u2019autant de controverses. J\u2019y vois plusieurs raisons : (i) la technique d\u2019impr\u00e9gnation par les sels m\u00e9talliques donnait des r\u00e9sultats difficilement reproductibles ; (ii) la structure du Golgi est complexe, associant saccules, v\u00e9sicules, tubules ; ses limites avec les organites voisins sont difficiles \u00e0 d\u00e9finir : o\u00f9 finit le reticulum endoplasmique ? o\u00f9 commence le Golgi ? Les d\u00e9bats entourant son existence et la terminologie \u00e0 employer pour le d\u00e9signer n\u2019emp\u00each\u00e8rent pas cet organite d\u2019\u00eatre l\u2019objet d\u2019un r\u00e9el engouement. De l\u2019abondante litt\u00e9rature qui lui fut consacr\u00e9e dans les ann\u00e9es suivant sa d\u00e9couverte, il ne subsiste \u00e0 peu pr\u00e8s rien qui soit digne d’int\u00e9r\u00eat. Au milieu du XXe<\/sup>si\u00e8cle, un demi-si\u00e8cle apr\u00e8s sa d\u00e9couverte, des microscopistes aussi exp\u00e9riment\u00e9s que George Palade et Albert Claude (The Rockefeller Institute for Medical Research<\/i>) soutenaient que l\u2019appareil r\u00e9ticulaire \u00e9tait un artefact de coloration consistant en formations my\u00e9liniques. Dans une communication faite en 1954 \u00e0 la Royal Society<\/i>, Claude mettait en garde contre \u00ab some artefacts such as the Golgi apparatus<\/i> \u00bb ! L\u2019av\u00e8nement du microscope \u00e9lectronique mit fin \u00e0 la controverse : l\u2019examen de coupes ultra-fines de cellules d\u2019\u00e9pididyme de rat impr\u00e9gn\u00e9es de sels m\u00e9talliques, par Albert Dalton et Marie D. Felix (National Cancer Institute, National Institutes of Health<\/i>), ou celles de pancr\u00e9as de souris par Fritiof S. Sj\u00f6strand et V. Hanzon (Department of Anatomy, Karolinska Institutet<\/i>, Stockholm) r\u00e9v\u00e9l\u00e8rent l\u2019architecture caract\u00e9ristique de l\u2019appareil de Golgi: un empilement de sacs membranaires aplatis (appel\u00e9s selon les auteurs : saccules, citernes, lamelles) entour\u00e9s de v\u00e9sicules. En hommage au travail de pionnier accompli par Albert Dalton, l\u2019organite fut baptis\u00e9 en 1956 \u00ab The Dalton complex<\/i> \u00bb. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Whaley WG The Golgi Apparatus<\/i> (1975)
\nPalade GE, Claude A The nature of the Golgi apparatus; identification of the Golgi apparatus with a complex of myelin figures<\/i> (1949)
\nPalade GE, Claude A The nature of the Golgi apparatus; parallelism between intercellular myelin figures and Golgi apparatus in somatic cells<\/i> (1949)
\nClaude A Cell Morphology and the Organization of Enzymic Systems in the Cytoplasm<\/i> (1954)
\nFarquhar MG, Palade GE The Golgi apparatus (complex)-(1954\u20131981)-from artifact to center stage<\/i> (1981)
\nDalton AJ, Felix MD Studies on the Golgi substance of the epithelial cells of the epididymis and duodenum of the mouse<\/i> (1953)
\nDalton AJ, Felix MD Cytologic and cytochemical characteristics of the Golgi substance of epithelial cells of the epididymis in situ, in homogenates and after isolation<\/i> (1954)
\nSj\u00f6strand FS, Hanzon V Ultrastructure of Golgi apparatus of exocrine cells of mouse pancreas<\/i> (1954)
\nDalton AJ, Felix MD A comparative study of the Golgi complex<\/i> (1956) <\/span><\/p>\n

Le complexe de Golgi est pr\u00e9sent dans toutes les cellules eucaryotes, animales et v\u00e9g\u00e9tales ; il est particuli\u00e8rement d\u00e9velopp\u00e9 dans les cellules \u00e0 forte activit\u00e9 s\u00e9cr\u00e9toire comme les cellules de l\u2019\u00e9pididyme ou du pancr\u00e9as exocrine. Si la morphologie microscopique d\u2019organites comme le noyau ou les mitochondries est bien d\u00e9finie et reconnaissable, ce n\u2019est que partiellement le cas pour le Golgi. Les premi\u00e8res observations ont \u00e9tabli (i) que le Golgi est g\u00e9n\u00e9ralement situ\u00e9 \u00e0 proximit\u00e9 du noyau et du centrosome, entre le reticulum endoplasmique et la membrane plasmique ; cela est particuli\u00e8rement le cas dans les cellules des glandes du tube digestif, dont la s\u00e9cr\u00e9tion est concentr\u00e9e \u00e0 un p\u00f4le de la cellule ; (ii) que le Golgi poss\u00e8de une polarit\u00e9 cis-trans, d\u00e9crite en 1957 chez les flagell\u00e9s par Pierre-Paul Grass\u00e9 (Universit\u00e9 de Paris) et, en 1963, chez les v\u00e9g\u00e9taux par Hilton H. Mollenhauer et Gordon Whaley (The Plant Research Institute, The University of Texas, Austin<\/i>). La structure golgienne la plus facilement reconnaissable est l\u2019empilement de citernes appel\u00e9 \u00ab dictyosome \u00bb ; sa forme varie avec le type cellulaire : des citernes de forme ovale agenc\u00e9es en panier (cellules de l\u2019\u00e9pididyme) ; un r\u00e9seau de rubans allong\u00e9s (cellules des acini pancr\u00e9atiques) ; une cage sph\u00e9rique (cellules de l\u2019hypophyse ant\u00e9rieure). Au sein du dictyosome, l\u2019examen au microscope \u00e9lectronique et l\u2019usage de r\u00e9actifs cytochimiques ont conduit \u00e0 distinguer des saccules cis, m\u00e9dianes et trans. Les autres structures golgiennes identifi\u00e9es sont des tubules, des v\u00e9sicules (50 \u00e0 100 nm) et des microv\u00e9sicules (5 \u00e0 10 nm).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Gatenby JB The Golgi apparatus of the living sympathetic ganglion cell of the mouse, photographed by phase-contrast microscopy<\/i> (1953)
\nWhaley WG, Mollenhauer HH, Kephart JE The Endoplasmic Reticulum and the Golgi Structures in Maize Root Cells<\/i> (1959)
\nMollenhauer HH, Zebrun W Permanganate fixation of the Golgi complex and other cytoplasmic structures of mammalian tests<\/i> (1960)
\nMollenhauer HH, Whaley WG An observation on the functioning of the Golgi apparatus<\/i> (1963)
\nFriend DS, Murray M Osmium impregnation of the Golgi apparatus<\/i> (1965)
\nCunningham WP, Morr\u00e9 DJ, Mollenhauer HH Structure of isolated plant Golgi apparatus revealed by negative staining<\/i> (1966)<\/span><\/p>\n

La premi\u00e8re tentative de reconstruction tridimensionnelle du Golgi fut entreprise par Albert Claude (Institut Bordet, Bruxelles) dans les ann\u00e9es 1970. Il examina au microscope \u00e9lectronique \u00e0 transmission des coupes s\u00e9ri\u00e9es – 200 coupes de 50 \u00e0 100 nanom\u00e8tres d\u2019\u00e9paisseur par cellule mais il ne disposait pas, \u00e0 l\u2019\u00e9poque de logiciels d\u2019imagerie informatiques pour int\u00e9grer les donn\u00e9es en une reconstitution fiable. L\u2019examen au microscope \u00e9lectronique \u00e0 balayage (Scannig Electron Microscopy<\/i>) a permis d\u2019obtenir, \u00e0 partir de coupes en s\u00e9rie impr\u00e9gn\u00e9es \u00e0 l\u2019acide osmique, des images \u00e0 haute r\u00e9solution du Golgi de cellules d\u2019\u00e9pididyme de rat, d\u2019acini pancr\u00e9atiques, de cellules gonadotropes du lobe ant\u00e9rieur de l\u2019hypophyse. Des progr\u00e8s significatifs ont \u00e9t\u00e9 accomplis dans la pr\u00e9servation de l\u2019architecture d\u00e9licate de cet organite ; les techniques de fixation bannissent l\u2019utilisation de produits chimiques agressifs. L\u2019\u00e9chantillon biologique est congel\u00e9 dans l\u2019azote liquide (-150\u00b0C) sous haute pression (plus de 2000 bars) pour \u00e9viter la formation de cristaux aqueux ; l\u2019eau est ensuite remplac\u00e9e par de la r\u00e9sine, infiltr\u00e9e \u00e0 basse temp\u00e9rature(-90\u00b0C) ; apr\u00e8s durcissement de la r\u00e9sine, les coupes sont pr\u00e9par\u00e9es par cryo-ultra microtomie. Elles peuvent \u00eatre examin\u00e9es en microscopie photonique \u00e0 super-r\u00e9solution (qui permet de franchir la limite de r\u00e9solution de 200 nm des microscopes optiques conventionnels) ; ou par microscopie \u00e9lectronique \u00e0 transmission. Des images tridimensionnelles jusqu\u2019\u00e0 une r\u00e9solution nanom\u00e9trique, ont \u00e9t\u00e9 obtenues par l\u2019usage (i) de techniques st\u00e9r\u00e9oscopiques sur coupes ultra-fines (100 nanom\u00e8tres), ou sur coupes \u00e9paisses sous tr\u00e8s hautes tensions, jusqu\u2019\u00e0 3.000.000 de volts (Alain Rambourg, CEA, Saclay) ; (ii) de la tomographie \u00e9lectronique associ\u00e9e \u00e0 la microscopie \u00e9lectronique (dual-axis electron microscope tomography<\/i>). Kathryn Howell (Department of Cellular and Structural Biology, The University of Colorado School of Medicine Denver<\/i>) et Richard McIntosh (Laboratory of Three-Dimensional Fine Structure, University of Colorado<\/i>) ont obtenu par tomographie tridimensionnelle une reconstruction tr\u00e8s d\u00e9taill\u00e9e de cellules \u00e9pith\u00e9liales de rein de rat (cellules NRK).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Claude A Interrelation of cytoplasmic membranes in mammalian liver cells : Endoplasmic reticulum and Golgi complex<\/i> (1968)
\nRambourg A, Clermont Y, Chr\u00e9tien M Tridimensional analysis of the formation of secretory vesicles in the Golgi apparatus of absorptive columnar cells of the mouse colon<\/i> (1989)
\nRambourg A, Clermont Y Three-dimensional electron microscopy: structure of the Golgi apparatus<\/i> (1990)
\nLadinsky MS, Mastronarde DN, McIntosh JR, Howell KE, Staehelin LA Golgi structure in three dimensions: functional insights from the normal rat kidney cell<\/i> (1999)<\/span><\/p>\n

L\u2019attention s\u2019est particuli\u00e8rement port\u00e9e sur les deux r\u00e9seaux membranaires encadrant les citernes m\u00e9dianes du dictyosome : la citerne cis est associ\u00e9e \u00e0 une structure appel\u00e9e \u00ab r\u00e9seau cis-golgien \u00bb (Cis Golgi Network<\/i>), form\u00e9e par l\u2019agr\u00e9gation de v\u00e9sicules issues par bourgeonnement du reticulum endoplasmique. La citerne trans fait partie d\u2019une structure complexe : le \u00ab r\u00e9seau trans-golgien \u00bb (Trans Golgi Network<\/i>). Autre point qui a mobilis\u00e9 l\u2019attention des chercheurs : le dictyosome est-il une structure unique dont les citernes sont reli\u00e9es entre elles par des connexions tubulaires ? De telles connexions ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9crite de fa\u00e7on convaincante : (i) dans les cellules \u00df de souris secr\u00e9tant de l\u2019insuline apr\u00e8s stimulation par du glucose (Kathryn Howell). (ii) dans les spermatides de rat (Alain Rambourg). L\u2019existence de connexions permanentes entre citernes pose le probl\u00e8me de savoir comment, dans ces conditions, les citernes parviennent \u00e0 conserver leur individualit\u00e9 biochimique et enzymatique.<\/p>\n\n\n\n\n
 \"chap7-1\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n
Complexe de Golgi d\u2019une cellule du pancr\u00e9as exocrine.<\/b>. Une matrice prot\u00e9ique maintient l\u2019architecture caract\u00e9ristique des citernes (ou saccules) et la polarit\u00e9 cis-trans du complexe. Un compartiment interm\u00e9diaire, le cis-Golgi, est intercal\u00e9 entre le Golgi et le r\u00e9ticulum endoplasmique. Il se forme par agr\u00e9gation de v\u00e9sicules issues du reticulum et transportant des prot\u00e9ines et des lipides nouvellement synth\u00e9tis\u00e9s. Un autre compartiment, le trans-Golgi est situ\u00e9 entre le Golgi et la membrane plasmique.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Clermont Y, Rambourg A, Hermo L Connections between the various elements of the cis- and mid-compartments of the Golgi apparatus of early rat spermatids<\/i> (1994)
\nClermont Y, Rambourg A, Hermo L Trans-Golgi network (TGN) of different cell types: three-dimensional structural characteristics and variability<\/i> (1995)
\nMarsh BJ, Volkmann N, McIntosh JR, Howell KE Direct continuities between cisternae at different levels of the Golgi complex in glucose-stimulated mouse islet beta cells<\/i> (2004)
\nTrucco A, Polishchuk RS, Martella O, Di Pentima A, Fusella A, Di Giandomenico D, San Pietro E, Beznoussenko GV, Polishchuk EV, Baldassarre M, Buccione R, Geerts WJC, Koster AJ, Burger KNJ, Mironov AA, Luini A Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments<\/i> (2004)<\/span><\/p>\n

D\u00e8s les ann\u00e9es 1960, on a \u00e9tabli qu\u2019en plus d\u2019une h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 morphologique le Golgi pr\u00e9sente une h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 biochimique ; le cis-Golgi fixe sp\u00e9cifiquement le marquage par l\u2019osmium (Daniel S. Friend et Michael J. Murray, Department of Pathology, University of California School of Medicine, San Francisco<\/i>). La r\u00e9action de Gomori ayant \u00e9t\u00e9 adapt\u00e9e \u00e0 la microscopie \u00e9lectronique, on a d\u00e9tect\u00e9 la pr\u00e9sence de phosphatases – thiamine pyrophosphatase, nucl\u00e9oside diphosphatase et cytidine monophosphatase – dans les saccules du trans-Golgi (Alex Novikoff et Sydney Goldfisher, Albert Einstein College of Medicine<\/i>), et d\u2019ad\u00e9nine dinucl\u00e9otide phosphatase dans les saccules m\u00e9dianes des am\u00e9loblastes de rat \u2013 les cellules qui fabriquent l\u2019\u00e9mail dentaire \u2013 (C.F. Smith, 1986, Department of Anatomy, Faculty of Dentistry, McGill University<\/i>).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Friend DS, Murray M Osmium impregnation of the Golgi apparatus<\/i> (1965)
\nNovikoff AB, Goldfisher S Nucleosidediphosphatase activity in the Golgi apparatus and its usefulness for cytological studies<\/i> (1961)
\nGoldfisher S, Essner E, Novikoff AB The localization of phosphatase activities at the level of ultrastructures<\/i> (1964)
\nRambourg A, Clermont Y, Marraud A Three-dimensional structure of the osmium-impregnated Golgi apparatus as seen in the high voltage electron microscope<\/i> (1974)<\/span><\/p>\n

<\/a>Complexe de Golgi et s\u00e9cr\u00e9tion<\/b><\/span><\/h3>\n

Les travaux de Santiago Ramon y Cajal sur les cellules caliciformes de l\u2019intestin, et plus tard ceux de Nassonov (Laboratorium des Abteiles f\u00fcr algemeine Morphologie, Leningrad<\/i>) sur les muqueuses des glandes d\u2019amphibien et les cellules pancr\u00e9atiques ont \u00e9tabli un lien entre cette structure et la s\u00e9cr\u00e9tion cellulaire.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Ramon y Cajal S Algunas variaciones ficiologica y pathologica del apparato reticular de Golgi<\/i> (1914)
\nNassonov DN Das Golgische Binnennetz und seine Beziehungen zu der Sekretion. Untersuchugen \u00fcber einige Amphibiendr\u00fcsen<\/i> (1923)<\/span><\/p>\n

Le pancr\u00e9as est un organe \u00e0 activit\u00e9 s\u00e9cr\u00e9toire \u00e9lev\u00e9e. Cette glande annexe du tube digestif (duod\u00e9num) est form\u00e9e de tissu exocrine (85% de la masse de l\u2019organe), et de tissu endocrine (3% de la masse). Deux types de cellules composent les \u00eelots de Langherans du tissu endocrine : (i) les cellules \u03b2, majoritaires (50 \u00e0 70% des cellules de l\u2019\u00eelot) synth\u00e9tisent et exportent l\u2019insuline, l\u2019amyline (Islet Amyloid Polypeptide<\/i>), la prot\u00e9ine C\u2026 ; (ii) les cellules \u03b1 synth\u00e9tisent le glucagon et la somatostatine. La glande exocrine est constitu\u00e9e d\u2019acinis de cinq \u00e0 dix cellules qui synth\u00e9tisent et exportent des enzymes, le plus souvent sous forme de pr\u00e9curseurs inactifs. Apr\u00e8s activation dans l\u2019intestin gr\u00eale, les proenzymes deviennent des enzymes actifs dig\u00e9rant les acides nucl\u00e9iques (DNAse, RNAse), les prot\u00e9ines (trypsinog\u00e8ne, chymotrypsinog\u00e8ne, procaboxy peptidases, \u00e9lastase), les lipides (lipase, phospholipase A2) et les hydrates de carbone (amylase). Les cellules acineuses sont polaris\u00e9es : le noyau et le reticulum endoplasmique occupent la portion basale ; le Golgi et les granules de s\u00e9cr\u00e9tion (grains de zymog\u00e8nes) occupent le p\u00f4le apical. Les s\u00e9cr\u00e9tions pancr\u00e9atiques sont d\u00e9clench\u00e9es par stimulation hormonale et sous influence nerveuse et nutritionnelle. Le contenu des granules de s\u00e9cr\u00e9tion se d\u00e9verse au p\u00f4le apical de la membrane plasmique dans des canalicules aboutissant au canal pancr\u00e9atique (canal de Wirsung) et \u00e0 la portion ant\u00e9rieure de l\u2019intestin gr\u00eale (duod\u00e9num). C\u2019est dans les cellules des acini pancr\u00e9atiques que George Palade (Rockefeller University<\/i>), \u00e0 la fin des ann\u00e9es 1960, mit en \u00e9vidence l\u2019existence de la voie s\u00e9cr\u00e9toire. Avec James Jamieson, ils pratiqu\u00e8rent des exp\u00e9riences de radio-marquage (pulse chase experiments<\/i>) : apr\u00e8s injection d\u2019acides amin\u00e9s radioactifs \u00e0 des cobayes, le pancr\u00e9as \u00e9tait pr\u00e9lev\u00e9 \u00e0 diff\u00e9rentes p\u00e9riodes de temps apr\u00e8s injection ; sur des fragments de tissu fix\u00e9s \u00e0 la glutarald\u00e9hyde et coup\u00e9s au microtome, l\u2019autoradiographie r\u00e9v\u00e9la le trajet des traceurs radioactifs du reticulum endoplasmique au complexe de Golgi puis aux grains de zymog\u00e8ne, o\u00f9 les proenzymes s\u2019accumulent avant leur exportation dans le tractus digestif.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Jamieson JD, Palade GE Role of the Golgi complex in the intracellular transport of secretory proteins<\/i> (1966)
\nJamieson JD, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell. I. Role of the peripheral elements of the Golgi complex<\/i> (1967)
\nJamieson JG, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell. II. Transport to Condensing Vacuoles and Zymogen Granules<\/i> (1967)<\/span><\/p>\n

Dix ans plus tard, Randy Schekman (University of California, Berkeley<\/i>) et son \u00e9tudiant, Peter Novick, d\u00e9couvrirent les mutants des g\u00e8nes SEC<\/i> chez la levure Saccharomyces cerevisiae<\/i>. En utilisant ces mutants, dont la croissance est sensible \u00e0 la temp\u00e9rature, ils diss\u00e9qu\u00e8rent les \u00e9tapes successives de la voie s\u00e9cr\u00e9toire. Ils d\u00e9couvrirent, par examen au microscope \u00e9lectronique, que chez les mutants sec<\/i> 1 les produits de s\u00e9cr\u00e9tion (phosphatase acide, invertase) s\u2019accumulent dans la cellule lorsque le milieu de culture passe de la temp\u00e9rature \u00ab permissive \u00bb \u00e0 une temp\u00e9rature plus \u00e9lev\u00e9e ; des v\u00e9sicules de s\u00e9cr\u00e9tion s\u2019accumulent entre le Golgi et la membrane plasmique. Novick et Schekman ont caract\u00e9ris\u00e9 23 g\u00e8nes SEC<\/i> dont les produits sont des r\u00e9gulateurs de la voie s\u00e9cr\u00e9toire. Au cours de la seule \u00e9tape de transition entre le Golgi et la membrane plasmique, ils ont mis en \u00e9vidence l\u2019intervention des produits de dix g\u00e8nes SEC<\/i>. Dans leur approche exp\u00e9rimentale, ils utilis\u00e8rent la technique des doubles mutants. En 1946, Theodosus Dobzhansky, l\u2019un des fondateurs de la Th\u00e9orie synth\u00e9tique de l\u2019\u00e9volution, a introduit la notion de \u00ab l\u00e9talit\u00e9 synth\u00e9tique \u00bb : c\u2019est un cas de mort cellulaire r\u00e9sultant de la mutation de deux g\u00e8nes diff\u00e9rents alors que la mutation d’un seul de ces deux g\u00e8nes n\u2019affecte pas la l\u00e9talit\u00e9. Si l\u2019on r\u00e9unit dans un double mutant les all\u00e8les de g\u00e8nes, fonctionnels lorsqu\u2019ils sont s\u00e9par\u00e9s et qui cessent de l\u2019\u00eatre dans le double mutant, cela peut \u00eatre interpr\u00e9t\u00e9 comme indiquant que les produits de ces g\u00e8nes interviennent dans la m\u00eame voie m\u00e9tabolique et m\u00eame dans la m\u00eame \u00e9tape de cette voie. Pour chaque mutation sec, Novick et Schekman ont s\u00e9lectionn\u00e9 un ou des all\u00e8les sensibles \u00e0 la temp\u00e9rature. C\u2019est gr\u00e2ce \u00e0 la technique des double-mutants qu\u2019ils ont pu mettre en \u00e9vidence des interactions entre g\u00e8nes impliqu\u00e9s dans des \u00e9tapes similaires de la voie s\u00e9cr\u00e9toire et d\u00e9couvrir de nouvelles interactions. Novick et Schekman ont utilis\u00e9 la centrifugation en gradient de densit\u00e9 pour s\u00e9parer les cellules de la souche sauvage des cellules sec mut\u00e9es ; le blocage de la voie s\u00e9cr\u00e9toire se traduit, chez les mutants, par une accumulation de membranes qui augmente la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre des cellules mut\u00e9es (plus \u00ab lourdes \u00bb). Ils ont \u00e9tabli la s\u00e9quence des \u00e9tapes de la voie s\u00e9cr\u00e9toire chez la levure : (i) formation de v\u00e9sicules transportant du mat\u00e9riel cargo \u00e0 partir du reticulum endoplasmique ; (ii) fusion des v\u00e9sicules avec le cis-Golgi ; (iii) transport ant\u00e9rograde des citernes du cis-Golgi vers le trans-Golgi ; (iv) fusion des v\u00e9sicules issues du trans-Golgi avec la membrane plasmique. Pour la petite histoire, il est int\u00e9ressant de savoir que les National Institutes of Health<\/i> ont rejet\u00e9 la premi\u00e8re demande de financement de Randy Schekman sous le pr\u00e9texte qu\u2019il n\u2019avait pas les connaissances requises pour entreprendre des recherches sur la s\u00e9cr\u00e9tion.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Jamieson JG, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell. IV. Metabolic requirement<\/i> (1968)
\nNovick P, Schekman R Secretion and cell-surface growth are blocked in a temperature-sensitive mutant of Saccharomyces cerevisiae<\/i> (1979)
\nNovick P, Field C, Schekman R Identification of 23 complementation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway<\/i> (1980)
\nNovick P, Ferro S, Schekman R Order of events in the yeast secretory pathway<\/i> (1981)
\nKaiser CA, Schekman R Distinct sets of SEC genes govern transport vesicle formation and fusion early in the secretory pathway<\/i> (1990)
\nFinger FP, Novick P Synthetic Interactions of the Post-Golgi sec Mutations of Saccharomyces cerevisiae<\/i> (2000)
\nDobzhansky T. Genetics of natural populations. XIII. Recombination ad variability in populations of Drosophila pseudoobscura<\/i> (1946)<\/span><\/p>\n

<\/a>Isoler le complexe de Golgi <\/b><\/span><\/h3>\n

La premi\u00e8re approche exp\u00e9rimentale utilis\u00e9e pour d\u00e9finir la composition biochimique du complexe de Golgi fut celle du fractionnement subcellulaire par centrifugation diff\u00e9rentielle et en gradient de densit\u00e9. L\u2019obtention de pr\u00e9parations purifi\u00e9es ne fut pas ais\u00e9e, s\u2019agissant d\u2019un composant mineur de la cellule : environ 1% de la masse des prot\u00e9ines cellulaires dans les h\u00e9patocytes contre 10% pour le noyau, 20% pour les mitochondries. En 1954 et 1959, Edward Kuff, Walter Schneider et Albert Dalton utilis\u00e8rent la centrifugation diff\u00e9rentielle combin\u00e9e \u00e0 la centrifugation en gradient de densit\u00e9 pour purifier l\u2019appareil de Golgi d\u2019\u00e9pididyme de rat (tr\u00e8s d\u00e9velopp\u00e9 dans les cellules endocrines). Les auteurs se content\u00e8rent de crit\u00e8res morphologiques pour caract\u00e9riser la fraction purifi\u00e9e, des crit\u00e8res d\u2019autant moins fiables que le broyage des tissus d\u00e9sagr\u00e8ge l\u2019organite. Ce n\u2019est qu\u2019en 1964 que les botanistes Hilton H. Mollenhauer et James D. Morr\u00e9 r\u00e9solurent cette difficult\u00e9 : la morphologie et la polarit\u00e9 cis-trans du complexe sont conserv\u00e9es en traitant les tissus \u00e0 la glutarald\u00e9hyde et en ajoutant un cation divalent (du calcium) au milieu d\u2019homog\u00e9n\u00e9isation (une solution de saccharose et de dextran). La m\u00eame ann\u00e9e, Sidney Goldfischer, E. Essner et Alex Novikoff (Albert Einstein College of Medicine<\/i>) mirent au point un test histochimique r\u00e9v\u00e9lant en microscopie la pr\u00e9sence de thiamine pyrophosphatase, un \u00ab enzyme marqueur \u00bb du Golgi. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Morr\u00e9 DJ, Mollenhauer HH Isolation of Golgi apparatus from plant cells<\/i> (1964)
\nMorr\u00e9 DJ, Mollenhauer HH, Chambers JE Glutaraldehyde stabilization as an aid to Golgi apparatus isolation<\/i> (1965)
\nMorr\u00e9 DJ, Hamilton RL, Mollenhauer HH, Lequire VS Isolation of a Golgi apparatus-rich fraction from rat liver. I. Method and morphology<\/i> (1970)
\nEhrenreich JH, Bergeron JJM, Siekevitz P, Palade GE Golgi Fractions Prepared from Rat Liver Homogenates I. Isolation Procedure and Morphological Characterization<\/i> (1973)<\/span><\/p>\n

En 1968, Mary-Jane Spiro et Robert G. Spiro (Glycoproteins and Biomembranes Research Laboratory, Joslin Diabetes Center and Harvard Medical School<\/i>) isol\u00e8rent \u00e0 partir de \u00ab particules \u00bb de glande thyro\u00efde, une sialyltransf\u00e9rase catalysant le transfert d\u2019acide sialique, \u00e0 partir de cytidine monophosphate N-ac\u00e9tylneuraminique acide sur des glycopeptides et des glycoprot\u00e9ines poss\u00e9dant un galactose en position terminale de leur cha\u00eene glycanique. Le pr\u00e9curseur des hormones thyro\u00efdiennes, la thyroglobuline, est une glycoprot\u00e9ine dont la cha\u00eene glycanique contient, entre autres sucres, du galactose et de l\u2019acide sialique. La m\u00eame ann\u00e9e, une galactosyltransf\u00e9rase fut identifi\u00e9e dans le lait ; le nucl\u00e9otide donneur de galactose \u00e9tait l\u2019UDP-galactose ; l\u2019accepteur de galactose \u00e9tait la N-ac\u00e9tyl glucosamine. En 1969, Rebecca Fleischer, Sidney Fleisher et Hidehiro Ozawa (Department of Molecular Biology, Vanderbilt University<\/i>) purifi\u00e8rent le complexe de Golgi de foie de b\u0153uf par centrifugation zonale. Cet organe volumineux fournissait suffisamment de mat\u00e9riel pour effectuer des analyses biochimiques sur la pr\u00e9paration purifi\u00e9e (le Golgi ne repr\u00e9sente qu\u2019une faible proportion des prot\u00e9ines de la cellule). La pr\u00e9paration purifi\u00e9e ne contenait que 0,2% de l\u2019activit\u00e9 galactosyltransf\u00e9rase de l\u2019homog\u00e9nat – elle n\u2019\u00e9tait que tr\u00e8s faiblement repr\u00e9sentative du Golgi – mais l\u2019activit\u00e9 enzymatique \u00e9tait enrichie 40 fois par rapport \u00e0 l\u2019homog\u00e9nat. Dans l\u2019article publi\u00e9 dans le Journal of Cell Biology<\/i> Rebecca Fleisher conclut que l\u2019UDP galactose :N-ac\u00e9tyl glucosamine galactosyltransf\u00e9rase est localis\u00e9e dans le complexe de Golgi. La pr\u00e9sence de glycosyltransf\u00e9rases dans cet organite fut confirm\u00e9e par diff\u00e9rents groupes de chercheurs. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Spiro MJ, Spiro RG Glycoprotein Biosynthesis: Studies on Thyroglobulin<\/i> (1968)
\nFleisher B, Fleisher S, Ozawa H Isolation and characterization of Golgi membranes from bovine liver<\/i> (1969) <\/span><\/p>\n

Le pathologiste et pionnier de l\u2019histochimie, Joseph F.A. McManus, a mis au point, au d\u00e9but des ann\u00e9es 1940, la m\u00e9thode de coloration \u00e0 l\u2019acide p\u00e9riodique et au r\u00e9actif de Schiff qui r\u00e9v\u00e8le la pr\u00e9sence de groupes ald\u00e9hydiques ; en 1948, il mit en \u00e9vidence la pr\u00e9sence de glycoprot\u00e9ines dans le tissu r\u00e9nal. Charles P. Leblond (Department of Anatomy, McGill University, Montr\u00e9al <\/i>) et ses collaborateurs entreprirent une s\u00e9rie d\u2019observations dont les r\u00e9sultats permirent de pr\u00e9ciser la fonction du Golgi : (i) en 1950, Leblond observa un marquage de cet organite sur des coupes d\u2019\u00e9pith\u00e9lium intestinal color\u00e9es par la technique de McManus, r\u00e9v\u00e9lant ainsi la pr\u00e9sence de sucres. Des observations similaires furent faites dans l\u2019hypophyse, le rein et la thyro\u00efde. (ii) En 1964, avec Marian Peterson, ils avanc\u00e8rent l\u2019hypoth\u00e8se que le Golgi est le site de glycosylation des prot\u00e9ines. (iii) Avec Alain Rambourg et William Hernandez, ils adapt\u00e8rent la coloration \u00e0 l\u2019acide p\u00e9riodique et au r\u00e9actif de Schiff \u00e0 la microscopie \u00e9lectronique, sur des coupes de tissus pr\u00e9alablement soumises \u00e0 une digestion par l\u2019\u03b1-amylase pour \u00e9liminer le glycog\u00e8ne pr\u00e9sent dans les cellules ; ils observ\u00e8rent un gradient de coloration allant du cis-Golgi au trans-Golgi. (iv) Leblond et Marian Neutra formul\u00e8rent l\u2019hypoth\u00e8se que les glycoprot\u00e9ines subissent une maturation dans le Golgi, avec addition s\u00e9quentielle de sucres d\u2019une citerne \u00e0 la suivante.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Leblond CP Distribution of periodic acid reactive carbohydrates in the adult rat <\/i> (1950)
\nPeterson M, Leblond CP Synthesis of complex carbohydrates in the Golgi region, as shown by radioautography after injection of labeled glucose <\/i> (1964)
\nRambourg A, Hernandez W, Leblond CP Detection of Complex Carbohydrates in the Golgi Apparatus of Rat Cells <\/i> (1969)
\nRambourg A, Hernandez W, Leblond CP Detection of periodic acid reactive carbohydrate in Golgi saccules <\/i> (1969) <\/span><\/p>\n

<\/a>Autoradiographie<\/b><\/span><\/h3>\n

Les recherches sur l\u2019incorporation de r\u00e9sidus glycosyl\u00e9s dans les polypeptides re\u00e7urent une impulsion d\u00e9cisive avec la mise \u00e0 la disposition des chercheurs d\u2019un nouvel outil : l\u2019autoradiographie combin\u00e9e \u00e0 la microscopie \u00e9lectronique. Apr\u00e8s la d\u00e9couverte de la radioactivit\u00e9 artificielle par les physiciens Ir\u00e8ne Curie et Fr\u00e9d\u00e9ric Joliot (tous deux prix Nobel de chimie en 1935), les isotopes radioactifs firent leur apparition dans les laboratoires. Fr\u00e9d\u00e9ric Joliot pr\u00e9dit l\u2019int\u00e9r\u00eat de ces isotopes en biologie exp\u00e9rimentale. En 1934, le bombardement d\u2019iode avec les rayons \u03b1 du polonium \u00e9mis dans le cyclotron du Coll\u00e8ge de France permit d\u2019obtenir l\u2019isotope 123<\/sup>I. Les premi\u00e8res tentatives de marquage d\u2019une hormone thyro\u00efdienne, la thyroxine, furent entreprises sous l\u2019\u00e9gide de Joliot. Antoine Lacassagne (Laboratoire de Synth\u00e8se Atomique, Paris) essaya d\u2019incorporer du polonium 210<\/sup>Po dans la paroi intestinale d\u2019un animal. En 1937, Charles Leblond essaya de marquer les hormones thyro\u00efdiennes en injectant de l\u2019iode radioactif (128<\/sup>I) \u00e0 des animaux. La r\u00e9v\u00e9lation se faisait par contact de coupes de tissu thyro\u00efdien avec une \u00e9mulsion photographique. Les r\u00e9sultats furent d\u00e9cevants en grande partie \u00e0 cause de la bri\u00e8vet\u00e9 de la demi-vie des radio-isotopes utilis\u00e9s.<\/p>\n

La production de radio\u00e9l\u00e9ments artificiels atteignit sa vitesse de croisi\u00e8re sous l\u2019\u00e9gide d\u2019Enrico Fermi (Los Alamos National Laboratory<\/i>, prix Nobel de physique en 1938). Le bombardement de mol\u00e9cules cibles par des neutrons produisit des isotopes du carbone (14<\/sup>C), du phosphore (32<\/sup>P) et du soufre (35<\/sup>S). Charles Leblond (McGill University<\/i>, Montr\u00e9al) reprit ses exp\u00e9riences de marquage, commenc\u00e9es au d\u00e9but des ann\u00e9es 1940, avec un isotope de l\u2019131<\/sup>I (demi-vie de 8 jours). Pour r\u00e9v\u00e9ler le marquage, il disposait de plaques photographiques sensibles. Il parvint ainsi \u00e0 montrer la pr\u00e9sence des grains d\u2019argent de l\u2019\u00e9mulsion photographique dans la zone des follicules thyro\u00efdiens. La r\u00e9solution \u00e9tant faible (100 microm\u00e8tres), le physicien Pierre Demers sugg\u00e9ra d\u2019appliquer directement sur la coupe histologique l\u2019\u00e9mulsion photographique liqu\u00e9fi\u00e9e de la firme Eastman Kodak<\/i>. La \u00ab coating technique<\/i> \u00bb fut mise au point par Leblond, L\u00e9onard B\u00e9langer, Rita Bogoroch et Beatrix Kopriwa. D\u2019am\u00e9liorations en perfectionnements on parvint, dans les ann\u00e9es 1960, \u00e0 l\u2019autoradiographie semi-quantitative \u00e0 haute r\u00e9solution, permettant de localiser avec pr\u00e9cision la position des grains d\u2019argent et de les compter sur une \u00e9mulsion d\u2019\u00e9paisseur calibr\u00e9e.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Leblond CP, Sue P Passage de l\u2019iode radioactif (I128<\/sup>) dans la thyro\u00efde stimul\u00e9e par l\u2019hormone thyr\u00e9otrope de l’hypophyse (1940)
\nLeblond CP Localization of newly administered iodine in the thyroid gland as indicated by radioiodine<\/i> (1943)
\nLeblond CP, B\u00e9langer LF A method for locating radioactive elements in tissues by covering histological sections with a photographic emulsion<\/i> (1946)
\nKopriwa BM A semiautomatic instrument for the radioautographic coating technique<\/i> (1966)<\/span><\/p>\n

Dans les cellules eucaryotes, la moiti\u00e9 des prot\u00e9ines sont des glycoprot\u00e9ines portant au moins une cha\u00eene oligosaccharidique (glycane) li\u00e9e par une liaison covalente \u00e0 un r\u00e9sidu d\u2019acide amin\u00e9. La taille du glycane est limit\u00e9e et sa s\u00e9quence est non-r\u00e9p\u00e9titive. On distingue des prot\u00e9ines N-glycosyl\u00e9es, o\u00f9 le glycane est li\u00e9 par une liaison \u03b2-N-osidique \u00e0 un r\u00e9sidu asparagine (Asn) ; et des prot\u00e9ines O-glycosyl\u00e9es ou le glycane est li\u00e9 par une liaison \u03b1-O-osidique \u00e0 un acide amin\u00e9 hydroxyl\u00e9 (s\u00e9rine, thr\u00e9onine, tyrosine, hydroxyproline, hydroxylysine). Dans les cellules, il existe des N-glycanes de type oligomannoside et des N-glycanes de type complexe. La portion interne du N-glycane est un pentasaccharide li\u00e9 par une de ses extr\u00e9mit\u00e9s \u00e0 une Asn ; \u00e0 l\u2019autre extr\u00e9mit\u00e9 sont branch\u00e9es des ramifications p\u00e9riph\u00e9riques variables en nombre et en longueur. Il existe une grande vari\u00e9t\u00e9 de glycoprot\u00e9ines.<\/p>\n

La ma\u00eetrise de l\u2019autoradiographie quantitative<\/b> permit \u00e0 Charles Leblond et coll. (Department of Anatomy, McGill University, Montr\u00e9al<\/i>) d\u2019\u00e9tudier le site d\u2019incorporation de sucres marqu\u00e9s au tritium dans des cellules de la muqueuse de l\u2019intestin gr\u00eale, du thymus ou du rein, de rat ou de souris. Marian Neutra et Charles Leblond inject\u00e8rent du 3<\/sup>H-galactose et du 3<\/sup>H-glucose \u00e0 des rats et \u00e9tudi\u00e8rent leur devenir dans des cellules \u00e0 forte activit\u00e9 s\u00e9cr\u00e9trices (chondrocytes du cartilage, cellules caliciformes de la muqueuse intestinale\u2026) par autoradiographie et microscopie \u00e9lectronique. En 1966, ils montr\u00e8rent que le site d\u2019incorporation du 3<\/sup>H-galactose et du 3<\/sup>H-glucose dans les glycoprot\u00e9ines est le complexe de Golgi.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Neutra M, Leblond CP Radioautographic comparison of the uptake of galactose-H3 and glucose-H3 in the golgi region of various cells secreting glycoproteins or mucopolysaccharides<\/i> (1966)
\nNeutra M, Leblond CP Synthesis of the carbohydrate of mucus in the golgi complex as shown by electron microscope radioautography of goblet cells from rats injected with glucose-H3<\/i> (1966)<\/span><\/p>\n

L\u2019utilisation de galactose dans les exp\u00e9riences effectu\u00e9es par Neutra et Leblond pr\u00e9sente un inconv\u00e9nient : il peut \u00eatre converti en glucose et incorpor\u00e9 dans le glycog\u00e8ne, ce qui complique l\u2019interpr\u00e9tation des r\u00e9sultats. Gary C. Bennett et Leblond remplac\u00e8rent le galactose par du 3<\/sup>H-fucose, qui poss\u00e8de un groupe m\u00e9thyle en C6<\/sub> \u00e0 la place du groupe hydroxyle du galactose. Le fucose est incorpor\u00e9, \u00e0 partir de GDP-fucose, par des fucosyl-transf\u00e9rases dans des N-glycanes, O-glycanes et des glycolipides. Bennett montra que l\u2019incorporation des sucres dans les glycoprot\u00e9ines int\u00e9grales de la membrane plasmique des cellules des tubules r\u00e9naux se fait d\u2019abord dans le Golgi, avant de migrer du Golgi \u00e0 la surface de la cellule.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Bennett G, Leblond CP Formation of cell coat material for the whole surface of columnar cells in the rat small intestine, as visualized by radioautography with L-fucose-3<\/sup>H<\/i> (1970)
\nBennett GC Synthesis and migration of glycoproteins in cells of the rat thymic medulla, as shown by radioautography after 3<\/sup>H-fucose injection<\/i> (1975)
\nHaddad A, Bennett G, Leblond CP Formation and turnover of plasma membrane glycoproteins in kidney tubules of young rats and adult mice, as shown by radioautography after an injection of 3<\/sup>H-fucose<\/i> (1977)<\/span><\/p>\n

<\/a>Sites de glycosylation<\/b><\/span><\/h3>\n

Vers le milieu des ann\u00e9es 1960, les biochimistes cherch\u00e8rent \u00e0 identifier le ou les sites subcellulaires de glycosylation des prot\u00e9ines. La partie polypeptidique des glycoprot\u00e9ines est-elle synth\u00e9tis\u00e9e par les ribosomes libres ou par les ribosomes li\u00e9s au reticulum endoplasmique ? La partie oligosaccharidique des glycoprot\u00e9ines est-elle incorpor\u00e9e au cours de la synth\u00e8se du polypeptide par les ribosomes ou dans un autre site qui restait \u00e0 d\u00e9couvrir ? L\u2019oligosaccharide est-il pr\u00e9alablement li\u00e9 \u00e0 des acides amin\u00e9s sp\u00e9cifiques sous forme d\u2019aminoacides-oligosaccharides, qui sont ensuite incorpor\u00e9s dans le polypeptide en cours de synth\u00e8se sur les ribosomes. Dans les exp\u00e9riences conduites par Edward J. Sarcione (Roswell Park Memorial Institute, Buffalo<\/i>) sur des microsomes de foie de rats, pr\u00e9alablement perfus\u00e9s avec des solutions contenant du 14<\/sup>C-galactose ou de la 3<\/sup>H-leucine (ou les deux), le marquage par la 3<\/sup>H-leucine se retrouvait dans la sous-fraction contenant les ribosomes et le marquage par le 14<\/sup>C-D-galactose ou le 14<\/sup>C-D-mannose dans la sous-fraction renfermant les prot\u00e9ines membranaires. L\u2019incorporation de sucres pendant la synth\u00e8se du polypeptide sur les ribosomes fut mise en \u00e9vidence par G. Ross Lawford et Harry Schachter (Department of Biochemistry, University of Toronto<\/i>) ; une certaine proportion de 14<\/sup>C-glucosamine est incorpor\u00e9e dans le polypeptide en cours d\u2019\u00e9longation par les ribosomes li\u00e9s \u00e0 la membrane. Des observations similaires, toujours avec la 14<\/sup>C-glucosamine, furent d\u00e9crites par Janos Molnar, G.B. Robinson et Richard J. Winzler (Department of Biological Chemistry, University of Illinois College of Medicine<\/i>) et par T. Hallinan et coll. (Department of Biochemistry, University of Sydney<\/i>). <\/p>\n

Une observation int\u00e9ressante fut rapport\u00e9e par Ronald R. Wagner et Morris A. Cynkin (Tufts University School of Medicine<\/i>) : le taux de transfert de la 14<\/sup>C-glucosamine est plus \u00e9lev\u00e9 dans les microsomes lisses de foie de rat que dans les microsomes rugueux. Avec Henri Beaufay et coll, nous avons montr\u00e9 que par centrifugation diff\u00e9rentielle de microsomes de foie de rat, le Golgi migre avec les microsomes lisses d\u00e9rivant de la fragmentation du reticulum endoplasmique pendant le broyage des tissus. Colvin M. Redman ( New York Blood Center<\/i>) montra que les prot\u00e9ines du s\u00e9rum, qui sont pour la plupart des glycoprot\u00e9ines, sont synth\u00e9tis\u00e9es par les polysomes li\u00e9s au reticulum endoplasmique des cellules h\u00e9patiques. Redman et M. George Cherian montr\u00e8rent que les sucres sont ajout\u00e9s au polypeptide apr\u00e8s d\u00e9charge vectorielle compl\u00e8te dans les v\u00e9sicules microsomiales, c\u2019est-\u00e0-dire apr\u00e8s que le polypeptide ait franchi la barri\u00e8re membranaire ; il existe au moins deux sites d\u2019incorporation des sucres au polypeptide : les microsomes rugueux pour la N-ac\u00e9tylglucosamine et le mannose et les microsomes lisses pour le galactose. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Sarcione EJ The Initial Subcellular site of Incorporation of Hexose into Liver Protein<\/i> (1964)
\nSarcione EJ, Carmody PJ Incorporation of D-galactose into liver microsomal protein in vitro<\/i> (1966)
\nLawford GR, Schachter H Biosynthesis of Glycoprotein by Liver: The Incorporation in vivo of 14<\/sup>C-Glucosamine into Protein-bound Hexosamine and Sialic Acid of Rat Liver Subcellular Fractions<\/i> (1966)
\nMolnar J, Robinson GB, Winzler RJ Biosynthesis of glycoproteins IV. The subcellular sites of incorporation of glucosamine-1-14<\/sup>C into glycoprotein in rat liver<\/i> (1964)
\nHallinan T, Murty CN, Grant JH The exclusive function of reticulum bound ribosomes in glycoprotein biosynthesis<\/i> (1968)
\nBeaufay H, Amar-Costesec A, Thin\u00e8s-Sempoux D, Wibo M, Robbi M, Berthet J Analytical Study of Microsomes and Isolated Subcellular Membranes from Rat Liver. III. Subfractionation of the Microsomal Fraction by Isopycnic and Differential Centrifugation in Density Gradients<\/i> (1974)
\nRedman CM The synthesis of serum proteins on attached rather than free ribosomes of rat liver<\/i> (1968)
\nWagner RR, Cynkin MA The Incorporation of 14<\/sup>C-glucosamine from UDP-N-acetyl-14<\/sup>C-glucosamine into liver microsomal protein in vitro<\/i> (1969)
\nRedman CM, Cherian MG The Secretory Pathways of Rat Serum Glycoproteins and Albumin. Localization of Newly Formed Proteins within the Endoplasmic Reticulum<\/i> (1972)<\/span><\/p>\n

J\u2019ai \u00e9voqu\u00e9, dans un paragraphe pr\u00e9c\u00e9dent, les difficult\u00e9s \u00e9prouv\u00e9es par les premiers chercheurs qui tent\u00e8rent de purifier le Golgi. Au d\u00e9but des ann\u00e9es 1970, les difficult\u00e9s techniques ayant \u00e9t\u00e9 r\u00e9solues, on entreprit d\u2019\u00e9tablir la composition enzymatique du Golgi. Apr\u00e8s le travail de Rebecca et Sidney Fleischer et Hideiro Ozawa (Department of Molecular Biology, Vanderbilt University<\/i>) qui montr\u00e8rent de fa\u00e7on plus ou moins convaincante la pr\u00e9sence de galactosyl-transf\u00e9rase dans le Golgi de foie de b\u0153uf, Harry Schachter et coll (Department of Biochemistry, University of Toronto<\/i>) ont d\u00e9crit la pr\u00e9sence, dans le Golgi de foie de rat, de sialyl-transf\u00e9rase, galactosyl-transf\u00e9rase et N-ac\u00e9tylglucosaminyl-transf\u00e9rase \u2013 les trois glycosyl-transf\u00e9rases catalysant le transfert du trisaccharide terminal de la cha\u00eene oligosaccharidique de nombreuses glycoprot\u00e9ines. Les r\u00e9sultats d\u2019autres travaux de ce type montr\u00e8rent la pr\u00e9sence dans le Golgi d\u2019enzymes catalysant le transfert de fucose sur la N-ac\u00e9tylglucosamine (N-glycosylation).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Schachter H, Jabbal L, Hudgin RL, Pinteric L, McGuire EJ, Roseman S Intracellular localization of liver sugar nucleotide glycoprotein glycosyltransferases in a Golgi-rich fraction<\/i> (1970)
\nWibo M, Godelaine D, Amar-Costesec A, Beaufay H Subcellular Location of Glycosyltransferases in Rat Liver<\/i> (1975)
\nRavoet AM, Amar-Costesec A, Beaufay H Topology of Mannosyltransferase, Glucosyltransferase and N-acetylglucosamine Phosphotransferase in rat liver<\/i> (1982)<\/span><\/p>\n

Le fait que la synth\u00e8se de la cha\u00eene oligosaccharidique des glycoprot\u00e9ines se fait par addition s\u00e9quentielle de sucres devait se refl\u00e9ter dans la r\u00e9partition des oligosaccharyl-transf\u00e9rases entre les diff\u00e9rents compartiments golgiens, du cis- au trans-Golgi. Diff\u00e9rents groupes de chercheurs tent\u00e8rent de mettre en \u00e9vidence cette h\u00e9t\u00e9rog\u00e9n\u00e9it\u00e9 enzymatique du Golgi en le sous-fractionnant et en s\u00e9parant les sous-fractions par centrifugation diff\u00e9rentielle et en gradient de densit\u00e9. Pour qu\u2019une approche exp\u00e9rimentale de ce type soit couronn\u00e9e de succ\u00e8s, il faut qu\u2019existent entre les entit\u00e9s golgiennes des diff\u00e9rences de taille (s\u00e9paration par centrifugation diff\u00e9rentielle) ou de densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre dans le gradient utilis\u00e9 (s\u00e9paration par centrifugation en gradient de densit\u00e9). L\u2019existence de telles diff\u00e9rences entre les composants v\u00e9siculaires, tubulaires ou sacculaires n\u2019a pas \u00e9t\u00e9 d\u00e9montr\u00e9e. On crut avoir trouv\u00e9 une solution en chargeant les v\u00e9sicules golgiennes en lipoprot\u00e9ines de tr\u00e8s faible densit\u00e9. C\u2019est le cas chez les rats auxquels on administre de l\u2019\u00e9thanol par intubation stomacale. Cette charge des v\u00e9sicules en lipoprot\u00e9ines offre un double avantage : (i) les lipoprot\u00e9ines, denses aux \u00e9lectrons, servent de marqueur morphologique en microscopie \u00e9lectronique en transmission ; (ii) les lipoprot\u00e9ines modifient la densit\u00e9 d\u2019\u00e9quilibre des v\u00e9sicules en la diminuant. John H. Ehrenreich, John J. Bergeron et George E. Palade (The Rockefeller University, New York<\/i>) appliqu\u00e8rent cette approche pour \u00e9tudier la distribution de l\u2019UDP-galactose: N-ac\u00e9tyl-glucosamine galactosyltransf\u00e9rase entre trois sous-fractions, et montrer que cet enzyme est ins\u00e9r\u00e9 dans la membrane. Albert Claude a observ\u00e9, au microscope \u00e9lectronique en transmission, que les v\u00e9sicules s\u00e9cr\u00e9toires dans lesquelles s\u2019accumulent les lipoprot\u00e9ines de tr\u00e8s faible densit\u00e9 ont un diam\u00e8tre de 400 \u00c5 et sont localis\u00e9es dans le trans-Golgi. Hilton Mollenhauer et coll. \u00e9tablirent la distribution de la galactosyl-transf\u00e9rase entre des sous-fractions de Golgi de foie de rat : v\u00e9sicules, tubules lisses et saccules (citernes). William D. Meritt et D. James Morr\u00e9 (Department of Biological Sciences, Purdue University, Lafayette<\/i>) ont montr\u00e9 que la galactosyl-transf\u00e9rase est pr\u00e9sente dans les fractions l\u00e9g\u00e8res du gradient, riches en v\u00e9sicules du trans-Golgi charg\u00e9es de lipoprot\u00e9ines de tr\u00e8s faible densit\u00e9. Ces r\u00e9sultats ne manquent pas d\u2019int\u00e9r\u00eat mais ils \u00e9taient loin d\u2019\u00eatre concluants ; pour r\u00e9soudre le probl\u00e8me de la localisation de toutes les glycosyl-transf\u00e9rases golgiennes parmi les diff\u00e9rents compartiments il fallait recourir \u00e0 d\u2019autres approches exp\u00e9rimentales. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Bergeron J, Palade GE, Siekevitz P Cell Fractionation Golgi bottom fraction<\/i> (1970)
\nClaude A Growth and Differentiation of Cytoplasmic Membranes in the Course of Lipoprotein Granule Synthesis in the Hepatic Cell I. Elaboration of Elements of the Golgi Complex<\/i> (1970)
\nOvtracht L, Morr\u00e9 DJ, Cheetham, Mollenhauer HH Subfractionation of Golgi apparatus from rat liver: method and morphology<\/i> (1973)
\nEhrenreich JH, Bergeron JJ, Siekevitz P, Palade GE Golgi fractions prepared from rat liver homogenates. I. Isolation procedure and morphological characterization<\/i> (1973)
\nBergeron JJ, Ehrenreich JH, Siekevitz P, Palade GE Golgi fractions prepared from rat liver homogenates. II. Biochemical characterization<\/i> (1973)
\nMerrit WD, Morr\u00e9 DJ A glycosyltransferase of high specific activity in secretory vesicles from isolated Golgi apparatus of rat liver<\/i> (1973)<\/span><\/p>\n\n\n\n\n
 \"chap7-2\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n
Lipoprot\u00e9ines dans l\u2019h\u00e9patocyte de rat<\/b>. Elles sont visibles sous forme de granules d\u2019environ 40 nanom\u00e8tres de diam\u00e8tre, denses aux \u00e9lectrons, dans le reticulum endoplasmique lisse, rarement dans le reticulum rugueux, dans les v\u00e9sicules de transport entre reticulum et cis-Golgi, \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 des citernes cis, m\u00e9diane et trans, dans le trans-Golgi et les granules de s\u00e9cr\u00e9tion.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

<\/a>Interm\u00e9diaires lipidiques<\/b><\/span><\/h3>\n

Luis F. Leloir re\u00e7ut une solide formation de biochimiste \u00e0 Cambridge, dans le laboratoire de Frederick Gowland Hopkins (prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine 1929), \u00e0 Saint Louis, chez Carl F. Cori (prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine 1947), et dans le laboratoire de David E. Green \u00e0 Columbia University<\/i>. En Argentine, Leloir \u00e9tudia le mode d\u2019assemblage des disaccharides : tr\u00e9halose (glucose + glucose) et saccharose (glucose + fructose), et du polysaccharide : glycog\u00e8ne, la forme de stockage du glucose dans les cellules animales, chez certains myc\u00e8tes et certaines bact\u00e9ries. En 1948, Leloir constata que pour \u00eatre transf\u00e9r\u00e9 sur un autre sucre, le glucose doit \u00eatre \u00ab activ\u00e9 \u00bb, c\u2019est-\u00e0-dire li\u00e9 \u00e0 un nucl\u00e9otide sous forme d\u2019uridine diphospho-glucose (UDP-O-Glc). A la suite de cette d\u00e9couverte, la recherche d\u2019autres nucl\u00e9otides donneurs de sucres conduisit, dans les ann\u00e9es 1950, \u00e0 la caract\u00e9risation d\u2019uridine diphospho-N-ac\u00e9tylglucosamine (UDP-GlcNac), de guanosine diphospho-mannose (GDP-Man) ; d\u2019ad\u00e9nosine diphospho-glucose (ADP-Glc), le donneur de glucose pour la synth\u00e8se de l\u2019amidon, la forme de stockage du glucose chez les v\u00e9g\u00e9taux chlorophylliens. Ces nucl\u00e9otides-sucres sont pr\u00e9sents dans le cytosol des cellules. Leloir re\u00e7ut en 1970 le prix Nobel de chimie pour avoir d\u00e9crit avec Carlos E. Cardini la voie biosynth\u00e9tique du glycog\u00e8ne (Uridine-diphospho glucose Pathway<\/i>).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Cardini CE, Paladini AC, Caputto R, Leloir LF Uridine Diphosphate Glucose: The Coenzyme of the Galactose\u2013Glucose Phosphate Isomerization<\/i> (1950)
\nLeloir LF The enzymatic transformation of uridine diphosphate glucose into a galactose derivative<\/i> (1951)<\/span><\/p>\n

La membrane plasmique des bact\u00e9ries est entour\u00e9e d\u2019une enveloppe renfermant des peptidoglycanes. En 1967, Yasushi Higashi, Jack L. Strominger et Charles C. Sweeley (Molecular and Cellular Biology, Harvard University<\/i>) d\u00e9couvrirent que chez Staphylococcus micrococcus<\/i> et chez Salmonella<\/i> le franchissement de la membrane plasmique par les sucres met en jeu des interm\u00e9diaires lipidiques phosphoryl\u00e9s, form\u00e9s d\u2019une longue cha\u00eene hydrocarbon\u00e9e, comme le poly-terp\u00e9no\u00efde bactopr\u00e9nol : C55<\/sub>H92<\/sub>O. En 1968, Malka Scher M, W.J. Lennarz et Charles C. Sweeley (Department of Physiological Chemistry, John Hopkins University School of Medicine, Baltimore<\/i>) ont isol\u00e9 de Micrococcus lysodeikticus<\/i> un poly-isopr\u00e9no\u00efde alcool en C55<\/sub>, form\u00e9 par l\u2019association de 11 unit\u00e9s isopr\u00e8ne et termin\u00e9 par un alcool. Outre l\u2019assemblage des peptidoglycanes et des liposaccharides de la paroi bact\u00e9rienne, ces interm\u00e9diaires lipidiques interviennent aussi dans l\u2019assemblage des glycoprot\u00e9ines membranaires des cellules eucaryotes et des glycoprot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires. L\u2019oligosaccharide, dont l\u2019assemblage a commenc\u00e9 sur la face cytosolique de la membrane du reticulum endoplasmique, doit franchir la barri\u00e8re de la bicouche lipidique pour \u00eatre transf\u00e9r\u00e9 sur un accepteur polypeptidique. C\u2019est l\u00e0 qu\u2019interviennent des d\u00e9riv\u00e9s phosphoryl\u00e9s d\u2019alcools \u00e0 longues cha\u00eenes appel\u00e9s poly-isopr\u00e9nols. Dans les cellules eucaryotes, Luis Leloir et Nicolas H. Behrens (Instituto de Investigaciones Bioqu\u00edmicas, Fundaci\u00f3n Campomar, Buenos Aires<\/i>) ont d\u00e9couvert le dolichol, le plus long lipide membranaire connu (jusqu\u2019\u00e0 105 atomes de C), form\u00e9 par l\u2019association de 17 \u00e0 21 unit\u00e9s isopr\u00e8ne. Dans la membrane du reticulum endoplasmique, o\u00f9 il est pr\u00e9sent sous forme d\u2019ester phosphorique, il sert d\u2019ancre lipidique pour l\u2019assemblage des N-glycanes avant leur transfert dans le lumen du reticulum endoplasmique. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Higashi Y, Strominger JL, Sweeley CC Structure of a lipid intermediate in cell wall peptidoglycan synthesis: a derivative of a C55<\/sub> isoprenoid alcohol <\/i> (1967)
\nHigashi Y, Strominger JL, Sweeley CC Biosynthesis of the Peptidoglycan of Bacterial Cell Walls XXI. Isolation of Free C55<\/sub>-Isoprenoid Alcohol and of Lipid Intermediates in Peptidoglycan Synthesis from Staphylococcus Aureus<\/i> (1970)
\nScher M, Lennarz WJ, Sweeley CC The biosynthesis of mannosyl-1-phosphoryl-polyisoprenol in Micrococcus lysodeikticus and its role in mannan synthesis<\/i> (1968)
\nBehrens NH, Leloir L Dolichol Monophosphate Glucose: An Intermediate in Glucose Transfer in Liver<\/i> (1970)<\/span><\/p>\n

L\u2019assemblage de l\u2019oligosaccharide est un processus complexe appel\u00e9 \u00ab cycle du dolichol\u00bb. La premi\u00e8re \u00e9tape est le transfert de N-ac\u00e9tylglucosamine phosphate (P-GlcNAc) \u00e0 partir d\u2019un nucl\u00e9otide-sucre :<\/p>\n

\"\"<\/a><\/p>\n

Cette r\u00e9action est catalys\u00e9e par un enzyme membranaire, l\u2019UDP-N-ac\u00e9tylglucosamine : dolichol-phosphate N-ac\u00e9tylglucosamine-1-P transf\u00e9rase. Il a \u00e9t\u00e9 s\u00e9quenc\u00e9 par Xiaying Zhu et Mark A. Lehrman (Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas<\/i>) ; il poss\u00e8de plusieurs h\u00e9lices transmembranaires et son site actif est situ\u00e9 sur la face cytosolique du reticulum endoplasmique. La liaison ester-diphosphate form\u00e9e \u00e0 l\u2019issue de la r\u00e9action est riche en \u00e9nergie ; c\u2019est la phase d\u2019\u00ab activation \u00bb du monosaccharide.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Zhu XY, Lehrman MA Cloning, sequence, and expression of a cDNA encoding hamster UDP-GlcNAc: dolichol phosphate N-acetylglucosamine-1-phosphate transferase<\/i> (1990)
\nDan N, Middleton RB, Lehrman MA Hamster UDP-N-acetylglucosamine:dolichol-P N-acetylglucosamine-1-P transferase has multiple transmembrane spans and a critical cytosolic loop<\/i> (1996)<\/span><\/p>\n

L\u2019assemblage de l\u2019oligosaccharide des glycoprot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires ou membranaires commence sur la face cytosolique de la membrane du reticulum endoplasmique. Les donneurs de sucres sont des nucl\u00e9otides ; l\u2019accepteur est le dolichol phosphate, une ancre lipidique ins\u00e9r\u00e9e dans la membrane. Les r\u00e9actions de transglycosylation sont catalys\u00e9es par des glycosyltransf\u00e9rases membranaires qui agissent s\u00e9quentiellement : (i) la N-ac\u00e9tyl-glucosaminyl phospho-transf\u00e9rase mentionn\u00e9e ci-dessus, un enzyme cl\u00e9 de la glycosylation des prot\u00e9ines ; (ii) une N-ac\u00e9tyl-glucosaminyltransf\u00e9rase qui a pour donneur l\u2019UDP-GlcNAc et pour accepteur le Dol-PP-GlcNAc ; (iii) des mannosyltransf\u00e9rases qui ont pour donneur le GDP-Man et pour accepteur le Dol-PP-GlcNAc2<\/sub>. L\u2019oligosaccharide interm\u00e9diaire :<\/p>\n

\"\"<\/a><\/p>\n

subit une translocation \u00e0 travers la bicouche phospholipidique de la membrane et migre de la face cytosolique \u00e0 la face luminale du reticulum endoplasmique. L\u2019enzyme impliqu\u00e9 est une flippase. L\u2019existence d\u2019enzymes de ce type avait \u00e9t\u00e9 pr\u00e9dite par Mark S. Bretscher, pour expliquer la diff\u00e9rence de composition en phospholipides entre les deux feuillets de la bicouche des membranes cellulaires. Sumana Sanyal, Christian G. Franck et Anant K. Menon (Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College, New York<\/i>) ont montr\u00e9 que la membrane du reticulum endoplasmique contient au moins deux flippases ; ces enzymes ont \u00e9t\u00e9 solubilis\u00e9s en traitant des microsomes de Saccharomyces cerevisiae<\/i>, par du Triton X-100 ; leur activit\u00e9 a \u00e9t\u00e9 \u00e9tudi\u00e9e apr\u00e8s reconstitution dans des prot\u00e9oliposomes ; leur fonctionnement ne requiert pas la pr\u00e9sence d\u2019ATP.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Sanyal S, Franck CG, Menon AK Distinct Flippases Translocate Glycerophospholipids and Oligosaccharide Diphosphate Dolichols across the Endoplasmic Reticulum<\/i> (2008)
\nSanyal S, Menon AK Specific transbilayer translocation of dolichol-linked oligosaccharides by an endoplasmic reticulum flippase<\/i> (2009)<\/span><\/p>\n

Pour identifier les sites de glycosylation et reconstituer les \u00e9tapes de la synth\u00e8se des oligosaccharides de type complexe, il fallait disposer d\u2019un syst\u00e8me exp\u00e9rimental simple. Sondra Schlesinger (Department of Microbiology and Immunology, Washington University School of Medicine, St. Louis<\/i>), sp\u00e9cialiste de la g\u00e9n\u00e9tique des bact\u00e9ries et de la r\u00e9plication des virus envelopp\u00e9s \u00e0 ARN, comme le virus Sindbis, sugg\u00e9ra \u00e0 Stuart Kornfeld d\u2019utiliser le Virus de la Stomatite V\u00e9siculaire (VSV) ; il appartient \u00e0 la famille des Rhabdoviridae<\/i> et provoque chez certains mammif\u00e8res une forme d\u2019influenza. Son g\u00e9nome \u00e0 ARN code cinq prot\u00e9ines majeures parmi lesquelles la glycoprot\u00e9ine G de l\u2019enveloppe virale (VSV-G). Le virus peut \u00eatre cultiv\u00e9 sur cellules ovariennes de hamster chinois et sur cellules de mammif\u00e8res infect\u00e9es par le virus, ou transfect\u00e9es avec le g\u00e8ne codant pour VSV-G ; la synth\u00e8se des prot\u00e9ines cellulaires est d\u00e9tourn\u00e9e au profit de la production de prot\u00e9ines virales.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Leavitt R, Schlesinger S, Kornfeld S Tunicamycin Inhibits Glycosylation and Multiplication of Sindbis and vesicular stomatitis viruses<\/i> (1977)
\nGibson R, Leavitt R, Kornfeld S, Schlesinger S Synthesis and infectivity of vesicular stomatitis virus containing nonglycosylated G protein<\/i> (1978)<\/span><\/p>\n

VSV-G porte une cha\u00eene oligosaccharidique de type N-glycane. Il existe un mutant VSV-G, sensible \u00e0 la temp\u00e9rature ; lorsque les cellules sont cultiv\u00e9es \u00e0 une temp\u00e9rature restrictive (40\u00b0C), la prot\u00e9ine synth\u00e9tis\u00e9e est mal conform\u00e9e et ne franchit pas le \u00ab contr\u00f4le de qualit\u00e9 \u00bb du reticulum endoplasmique. Si l\u2019on revient \u00e0 la temp\u00e9rature permissive (32\u00b0C), la prot\u00e9ine mal repli\u00e9e adopte sa conformation normale, franchit le contr\u00f4le de qualit\u00e9 et passe du reticulum endoplasmique au complexe de Golgi. Le passage de la temp\u00e9rature permissive \u00e0 la temp\u00e9rature restrictive bloque une \u00e9tape de la voie s\u00e9cr\u00e9toire ; on peut alors d\u00e9terminer la composition en sucres de la cha\u00eene glycanique \u00e0 cette \u00e9tape. Des anticorps sp\u00e9cifiques anti VSV-G sont employ\u00e9s pour l\u2019immuno-localisation de la glycoprot\u00e9ine au microscope. Le degr\u00e9 de r\u00e9solution peut \u00eatre augment\u00e9 en utilisant un g\u00e8ne hybride qui permet de coupler la VSV-G \u00e0 la prot\u00e9ine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein<\/i>, GFP). En 1962, Osamu Shimomura (Boston University School of Medicine<\/i>) a d\u00e9couvert dans les cellules de la m\u00e9duse Aequorea victoria<\/i> une prot\u00e9ine \u00e9mettant une fluorescence verte apr\u00e8s excitation lumineuse dans l\u2019ultraviolet. Martin Chalfie (Columbia University<\/i>) comprit tout l\u2019int\u00e9r\u00eat que pr\u00e9sente cette prot\u00e9ine verte fluorescente comme marqueur en biologie. Roger Yonchien Tsien (University of California, San Diego<\/i>) \u00e9largit la gamme des longueurs d\u2019onde d\u2019excitation et d\u2019\u00e9mission utilisables en construisant des prot\u00e9ines modifi\u00e9es plus fluorescentes et \u00e9mettant une lumi\u00e8re jaune, bleue ou violette, permettant d\u2019aborder simultan\u00e9ment l\u2019\u00e9tude de plusieurs processus intracellulaires. Shimomura, Chalfie et Tsien re\u00e7urent le prix Nobel de chimie en 2008. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Shimomura O Extraction, purification and properties of Aequorin, a bioluminescent protein from luminous hydromedusan, Aequora<\/i> (1962)
\nChalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression<\/i> (1994)
\nMaiti A, Buffalo CZ, Saumya S, Montecinos-Franjola F, Hachey JS, Conlon WJ, Tran GN, Hassan B, Walters KJ, Drobizhev M, Moerner WE, Ghosh P, Matsuo H, Tsien RY, Lin JY, Rodriguez EA Structural and photophysical characterization of the small ultra-red fluorescent protein<\/i> (2023)<\/span><\/p>\n

La fusion du g\u00e8ne codant pour la glycoprot\u00e9ine VSV-G (normale ou mut\u00e9e) avec celui codant pour GFP produit un g\u00e8ne hybride que l\u2019on peut introduire par transfection dans le g\u00e9nome d\u2019une cellule ; il devient alors possible de visualiser en microscopie \u00e0 fluorescence le d\u00e9placement de la prot\u00e9ine G du reticulum endoplasmique \u00e0 la membrane plasmique en passant par le Golgi. Le volume de la prot\u00e9ine hybride aurait pu perturber son cheminement le long de la voie s\u00e9cr\u00e9toire ; \u00e0 l\u2019heureuse surprise des exp\u00e9rimentateurs, il n\u2019en a rien \u00e9t\u00e9. L\u2019usage des prot\u00e9ines hybrides VSV-G – GFP a \u00e9t\u00e9 largement utilis\u00e9 dans l\u2019\u00e9tude de la voie s\u00e9cr\u00e9toire. Les sites intracellulaires de glycosylation de la VSV-G ont \u00e9t\u00e9 identifi\u00e9s par Lawrence A. Summers, James R. Etchison et Donald F. Summers (Department of Microbiology, University of Utah College of Medicine, Salt Lake City<\/i>) dans les cellules HeLa et BHK21, infect\u00e9es par le virus et marqu\u00e9es (pulse chase<\/i>) avec des sucres triti\u00e9s (3<\/sup>H). Apr\u00e8s fractionnement par centrifugation, ils ont caract\u00e9ris\u00e9 le site d\u2019incorporation de la glucosamine et du mannose dans la fraction enrichie en reticulum endoplasmique rugueux ; les sucres p\u00e9riph\u00e9riques – galactose, acide sialique, fucose, et peut-\u00eatre une autre glucosamine \u2013 sont incorpor\u00e9s dans la fraction membranaire de faible densit\u00e9 (enrichie en v\u00e9sicules et tubules lisses d\u00e9rivant du reticulum endoplasmique et du complexe de Golgi). Ils ont \u00e9galement mis en \u00e9vidence qu\u2019avant addition de l\u2019acide sialique en position terminale de la cha\u00eene glycanique, l\u2019oligosaccharide polymannosyl\u00e9 et glucosyl\u00e9 subit un \u00e9lagage. VSV-G est une glycoprot\u00e9ine membranaires. Seymour J. Singer (University of California, San Diego<\/i>), l\u2019inventeur avec Garth L. Nicolson (Salk Institute for Biological Studies, La Jolla<\/i>) du mod\u00e8le de la \u00ab mosa\u00efque fluide \u00bb, a suivi son parcoursdans les cellules ovariennes de hamster chinois infect\u00e9es par le VSV. Pour synchroniser le cheminement des VSV-G nouvellement synth\u00e9tis\u00e9es, John E. Bergman a utilis\u00e9 un mutant sensible \u00e0 la temp\u00e9rature. La s\u00e9quence des \u00e9tapes, du reticulum endoplasmique \u00e0 la membrane plasmique, a \u00e9t\u00e9 suivie par immunofluorescence et immunomicroscopie \u00e9lectronique sur coupes ultra fines. Utilisant un syst\u00e8me de synth\u00e8se prot\u00e9ique in vitro<\/i> – extrait de germe de bl\u00e9 en pr\u00e9sence de microsomes de pancr\u00e9as – Harvey F. Lodish et coll. ont d\u00e9montr\u00e9 que l\u2019insertion de VSV-G dans la membrane du reticulum endoplasmique s\u2019effectue pendant la synth\u00e8se du polypeptide ; l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 carboxy-terminale (la plus courte) \u00e9merge sur la face cytosolique de la membrane ; l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 amino-terminale (l\u2019essentiel de la prot\u00e9ines) est situ\u00e9e dans le lumen, o\u00f9 s\u2019effectue l\u2019addition de la cha\u00eene glycanique.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Hunt LA, Summers DF Glycosylation of vesicular stomatitis virus glycoprotein in virus-infected HeLa cells<\/i> (1976)
\nHunt LA, Etchison JR, Summers DF Oligosaccharide chains are trimmed during synthesis of the envelope glycoprotein of vesicular stomatitis virus<\/i> (1977)
\nKatz FN, Rothman JE, Lingappa VR, Blobel G, Lodish HF Membrane assembly in vitro: synthesis, glycosylation, and asymmetric insertion of a transmembrane protein<\/i> (1977)
\nKatz FN, Rothman JE, Knipe DM, Lodish HF Membrane assembly: synthesis and intracellular processing of the vesicular stomatitis virus glycoprotein<\/i> (1977)
\nZilberstein A, Snider MD, Porter M, Lodish HF Mutants of vesicular stomatitis virus blocked at different stages in maturation of the viral glycoprotein<\/i> (1980)
\nBergmann JE, Tokuyasu KT, Singer SJ Passage of an integral membrane protein, the vesicular stomatitis virus glycoprotein, through the Golgi apparatus en route to the plasma membrane<\/i> (1981)<\/span><\/p>\n

Les trois types d\u2019oligosaccharides assembl\u00e9s dans le reticulum endoplasmique et le Golgi sont : (i) les oligosaccharides de type complexe : GlcNAc2<\/sub>-Man3<\/sub>-GlcNAc2<\/sub>-Gal2<\/sub> ; (ii) les oligosaccharides riche en mannose : GlcNAc2<\/sub>-Man7<\/sub> ; (iii) les oligosaccharides de type hybride : GlcNAc2<\/sub>-Man7<\/sub>-GlcNAc2<\/sub>-Gal2<\/sub>.<\/p>\n\n\n\n\n
 \"form7-1\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n
Cha\u00eene oligosaccharidique de type complexe li\u00e9e \u00e0 un r\u00e9sidu asparagine (Asn) d\u2019une glycoprot\u00e9ine.<\/b> Cette structure pr\u00e9sente dans des glycoprot\u00e9ines de la membrane plasmique ou dans les glycoprot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9t\u00e9es est conserv\u00e9e de la levure \u00e0 l\u2019homme.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

La biosynth\u00e8se des oligosaccharides de type complexe, commence sur la face cytosolique de la membrane du reticulum endoplasmique et se poursuit sur la face luminale. Les r\u00e9actions sont catalys\u00e9es par des mannosyl- et glucosyl-transf\u00e9rases, dont le site catalytique est orient\u00e9 vers le lumen ; les donneurs de mannose et de glucose sont des nucl\u00e9otides-sucres : GDP-mannose, UDP-glucose, synth\u00e9tis\u00e9s dans le cytosol et transport\u00e9s dans le lumen par les transporteurs de nucl\u00e9otides-sucres ; l\u2019accepteur luminal est le Dol-P-P-GlcNAc2<\/sub>-Man5<\/sub> et le produit de la r\u00e9action est le Dol-PP-t\u00e9trad\u00e9ca-saccharide : <\/p>\n\n\n\n\n
 \"form7-2\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n
Cha\u00eene oligomannosidique li\u00e9e au dolichol pyrophosphate.<\/b> Ce type de cha\u00eene est pr\u00e9sent dans le reticulum endoplasmique.<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

Le second enzyme-cl\u00e9 de la voie biosynth\u00e9tique des glycoprot\u00e9ines, l\u2019oligosaccharyl-tranf\u00e9rase, catalyse la r\u00e9action :<\/p>\n

\"\"<\/a><\/p>\n

avec formation d\u2019une liaison N-\u00df D-glycosyle entre le t\u00e9trad\u00e9ca-saccharide et l\u2019asparagine du tripeptide Asn-aa-Ser\/Thr, o\u00f9 aa est un acide amin\u00e9 prot\u00e9inog\u00e8ne \u00e0 l\u2019exclusion de la proline. L\u2019oligosaccharyl-transf\u00e9rase est un h\u00e9t\u00e9ro oligom\u00e8re compos\u00e9 de huit sous-unit\u00e9s parmi lesquelles les ribophorines I et II d\u00e9couvertes par Gert Kreibich et David Sabatini (Department of Cell Biology, New York University School of Medicine<\/i>). Le transfert co-traductionnel de l\u2019oligosaccharide se fait \u00e0 proximit\u00e9 du site o\u00f9 le polypeptide \u00e9merge du ribosome si bien que le translocon (dont il sera question plus loin) et l\u2019oligosaccharyl transf\u00e9rase ne forment qu\u2019une seule superstructure mol\u00e9culaire du domaine ribosomal du reticulum endoplasmique (Alain Amar-Costesec et Henri Beaufay, 1981). Imm\u00e9diatement apr\u00e8s le transfert co-traductionnel du t\u00e9trad\u00e9ca-saccharide sur la cha\u00eene peptidique naissante, le glucose terminal est retir\u00e9 par la glucosidase I. Kunwar Shailubhai, Budhan S Pukazhenthi et coll. (Department of Animal Sciences, University of Maryland<\/i>) ont montr\u00e9 que le site actif de cet enzyme transmembranaire est localis\u00e9 dans le lumen. L\u2019oligosaccharide li\u00e9 au polypeptide :<\/p>\n

\"\"<\/a><\/p>\n

est reconnu par la malectine, caract\u00e9ris\u00e9e par Thomas Schallus et coll (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg<\/i>) ; cette prot\u00e9ine membranaire du reticulum endoplasmique participe au recrutement de la glucosidase II, un h\u00e9t\u00e9rodim\u00e8re qui hydrolyse la liaison \u03b1-1,3 de deux mol\u00e9cules de glucose pour donner naissance \u00e0 l\u2019oligosaccharide li\u00e9 au polypeptide :<\/p>\n

\"\"<\/a><\/p>\n

reconnu par les chaperonnes calnexine et calr\u00e9ticuline, qui aident la glycoprot\u00e9ine n\u00e9oform\u00e9e \u00e0 adopter ses structures secondaire et tertiaire.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Kreibich G, Ulrich BL, Sabatini DD Protein of rough microsomal membranes related to ribosome binding. I. Identification of ribophorins I and II, membrane proteins characteristic of rough microsomes<\/i> (1978)
\nAmar-Costesec A, Beaufay H A structural basis of enzymic heterogeneity within liver endoplasmic reticulum<\/i> (1981)
\nShailubhai K, Pukazhenthi BS, Saxena ES, Varma GM, Vijay IK Glucosidase I, a transmembrane endoplasmic reticular glycoprotein with a luminal catalytic domain<\/i> (1991)
\nSchallus T, Jaeckh C, Feh\u00e9r K, Palma AS, Liu Y, Simpson JC, Mackeen M, Stier G, Gibson TJ, Feizi T, Muhle-Goll C Malectin: A Novel Carbohydrate-binding Protein of the Endoplasmic Reticulum and a Candidate Player in the Early Steps of Protein N-Glycosylation<\/i> (2008)
\nStrous GJ, Van Kerkhof P, Brok R, Roth J Brada D Glucosidase II, a protein of the endoplasmic reticulum with high mannose oligosaccharide chains and a rapid turnover<\/i> (1987)
\nPelletier MF, Marcil A, Sevigny G, Jakob CA, Tessier DC, Chevet E, Menard R, Bergeron JJ, Thomas DY The heterodimeric structure of glucosidase II is required for its activity, solubility, and localization in vivo<\/i> (2000)
\nWare FE, Vassilakos A, Peterson PA, Jackson MR, Lehrman MA, Williams DB The molecular chaperone calnexin binds Glc1Man9GlcNAc2 oligosaccharide as an initial step in recognizing unfolded glycoproteins<\/i> (1995)<\/span><\/p>\n

La phase d\u2019\u00e9lagage de l\u2019oligosaccharide a d\u2019abord intrigu\u00e9 les biochimistes ; la n\u00e9cessit\u00e9 de ce processus de d\u00e9molition partielle d\u2019un glycane qui vient juste d\u2019\u00eatre assembl\u00e9 n\u2019apparut pas de prime abord jusqu\u2019\u00e0 la d\u00e9couverte du \u00ab cycle de contr\u00f4le de qualit\u00e9 \u00bb. Il convient de souligner l\u2019importance de ce contr\u00f4le qui se d\u00e9roule dans le reticulum endoplasmique et concerne tous les polypeptides n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9s par les ribosomes li\u00e9s \u00e0 la membrane : l\u2019apparition \u00e0 la surface des cellules d\u2019une glycoprot\u00e9ine membranaire de conformation anormale peut provoquer le d\u00e9clenchement d\u2019une r\u00e9action immunitaire d\u00e9vastatrice. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Williams DB Beyond lectins: the calnexin\/calreticulin chaperone system of the endoplasmic reticulum<\/i> (2006)
\nEllgaard L, McCaul N, Chatsisvili A, Braakman I Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER<\/i> (2016)<\/span><\/p>\n

Pour que les glycoprot\u00e9ines solubles ou membranaires acqui\u00e8rent leur structure tertiaire, elles sont, d\u00e8s leur translocation dans le lumen du reticulum endoplasmique, prises en charge par des chaperonnes. La \u00ab voie g\u00e9n\u00e9rale \u00bb met en \u0153uvre la chaperonne BIP et la prot\u00e9ine disulfure isom\u00e9rase. La Binding Immunoglobulin Protein<\/i>, tr\u00e8s abondante dans le r\u00e9ticuloplasme, est l’homologue de la prot\u00e9ine de choc thermique de 70 kDa (Heat Shock Protein<\/i> 70) ; comme toutes les prot\u00e9ines de cette famille, elle est produite en grande quantit\u00e9 lorsque la cellule est soumise \u00e0 une \u00e9l\u00e9vation de temp\u00e9rature ; BIP maintient les polypeptides naissants dans un \u00e9tat propice \u00e0 leur repliement correct. Un \u00e9l\u00e9ment important de l\u2019acquisition de la structure tertiaire est l\u2019\u00e9tablissement de ponts disulfure entre les atomes de S des fonctions thiol de deux cyst\u00e9ines. Cette modification post-traductionnelle est catalys\u00e9e par la prot\u00e9ine disulfure isom\u00e9rase ; la PDIA 3 (Endoplasmic Reticulum Protein<\/i> 57 ou 59) et ERp72, isol\u00e9es par Richard A. Mazzarella et coll. (Department of Microbiology, St. Louis University School of Medicine<\/i>), sont des r\u00e9sidents permanents du reticulum endoplasmique ; elles poss\u00e8dent \u00e0 leur extr\u00e9mit\u00e9 carboxy-terminale les signaux de r\u00e9tention KDEL et KEEL, respectivement (voir plus loin). <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Mazzarella RA, Srinivasan M, Haugejorden SM, Green M ERp72, an abundant luminal endoplasmic reticulum protein, contains three copies of the active site sequences of protein disulfide isomerase<\/i> (1990)<\/span><\/p>\n

<\/a>Contr\u00f4le de qualit\u00e9<\/b><\/span><\/h3>\n

Les prot\u00e9ines ayant acquis leur structure tridimensionnelle correcte sont transf\u00e9r\u00e9es vers le Golgi ; celles qui sont incorrectement repli\u00e9es ou assembl\u00e9es sont re-glucosyl\u00e9es par l’UDP-glucose: glycoprot\u00e9ine glucosyl transf\u00e9rase ; elles subissent alors un tour suppl\u00e9mentaire du cycle calnexine-calr\u00e9ticuline. Richard K Plemper et coll., dans le groupe de Dieter H Wolf (Institut f\u00fcr Biochemie, Universit\u00e4t Stuttgart<\/i>) ont montr\u00e9 que les glycoprot\u00e9ines recal\u00e9es, apr\u00e8s plusieurs cycles de contr\u00f4le de qualit\u00e9, sont partiellement d\u00e9glycosyl\u00e9es, expuls\u00e9es du r\u00e9ticuloplasme \u00e0 travers le r\u00e9tro-translocon (Sec 61), et d\u00e9grad\u00e9es par le syst\u00e8me cytosolique ubiquitine prot\u00e9asome. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Bordallo J, Plemper RK, Finger A, Wolf DH Der3p\/Hrd1p is Required for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Misfolded Lumenal and Integral Membrane Proteins<\/i> (1998)
\nPlemper RK, Bordallo J, Deak PM, Taxis C, Hitt R, Wolf DH Genetic interactions of Hrd3p and Der3p\/Hrd1p with Sec61p suggest a retro-translocation complex mediating protein transport for ER degradation<\/i> (1999)<\/span><\/p>\n

Les glycoprot\u00e9ines solubles ayant acquis leur structure tridimensionnelle correcte sont tri\u00e9es dans le reticulum endoplasmique ; (i) celles qui portent \u00e0 leur extr\u00e9mit\u00e9 carboxy-terminale un signal de r\u00e9tention sous forme du t\u00e9trapeptide Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) deviennent des r\u00e9sidentes permanentes du reticulum : calr\u00e9ticuline (Calcium Binding Protein<\/i> 3), Glucose Regulated Protein<\/i> 94 (CaBP4), calnexine, prot\u00e9ine disulfure isom\u00e9rase, prot\u00e9ine de 78k (Glucose Regulated Protein<\/i> 78), prot\u00e9ine de choc thermique 90k, CaBP1 (membre de la famille de la thior\u00e9doxine), Endoplasmic Reticulum Chaperone Protein GRP94<\/i> (CaBP4) pr\u00e9sente dans le reticulum endoplasmique lisse\u2026 Pour les glycoprot\u00e9ines membranaires, le signal de r\u00e9tention serait localis\u00e9 dans un domaine hydrophobe amino-terminal ou dans le domaine transmembranaire. Les glycoprot\u00e9ines d\u00e9pourvues de signal de r\u00e9tention sont transport\u00e9es par une noria de v\u00e9sicules et acc\u00e8dent aux compartiments suivants : complexe de Golgi, membrane plasmique, ou sont export\u00e9es \u00e0 l\u2019ext\u00e9rieur de la cellule.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : P\u00e4\u00e4bo S, Bhat BM, Wold WS, Peterson PA A short sequence in the COOH-terminus makes an adenovirus membrane glycoprotein a resident of the endoplasmic reticulum<\/i> (1987)
\nMunro S, Pelham HR A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins<\/i> (1987)
\nPeter F, Nguyen Van P, S\u00f6ling HD Different sorting of Lys-Asp-Glu-Leu proteins in rat liver<\/i> (1992)
\nPoruchynsky MS, Tyndall C, Both GW, Sato F, Bellamy AR, Atkinson PH Deletions into an NH2-terminal hydrophobic domain result in secretion of rotavirus VP7, a resident endoplasmic reticulum membrane glycoprotein<\/i> (1985)
\nMachamer CE, Rose JK A specific transmembrane domain of a coronavirus E1 glycoprotein is required for its retention in the Golgi region<\/i> (1987)<\/span><\/p>\n

Le cycle calnexine\/calr\u00e9ticuline de contr\u00f4le de qualit\u00e9 met en jeu deux prot\u00e9ines dont les \u00ab domaines lectine \u00bb pr\u00e9sentent des similarit\u00e9s de s\u00e9quence. Ayant fait l\u2019objet d\u2019\u00e9tudes dans le groupe de Marek Michalak (Department of Biochemistry, University of Alberta<\/i>), calnexine et calr\u00e9ticuline sont des chaperonnes fixant le Ca2+<\/sup>; elles ne reconnaissent que les glycoprot\u00e9ines n\u00e9o-synth\u00e9tis\u00e9es portant un glucose \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 de leur glycane li\u00e9 \u00e0 N :<\/p>\n

\"\"<\/a><\/p>\n

Comme BIP, calr\u00e9ticuline et calnexine ont pour fonction d\u2019assister le processus de \u00ab repliement \u00bb des polypeptides et l\u2019acquisition des structures secondaires (h\u00e9lice \u03b1, feuillet pliss\u00e9 \u03b2) et tertiaires. La calr\u00e9ticuline est pr\u00e9sente dans l\u2019espace luminal. La calnexine appartient \u00e0 une famille de chaperonnes mol\u00e9culaires ; elle a \u00e9t\u00e9 d\u00e9tect\u00e9e en 1982 dans le reticulum endoplasmique de diff\u00e9rents tissus et cellules sous forme d\u2019une prot\u00e9ine de masse mol\u00e9culaire apparente 90 kDa. C\u2019est une prot\u00e9ine transmembranaire exprim\u00e9e dans les portions lisse et rugueuse du reticulum endoplasmique. Sa s\u00e9quence primaire est hautement conserv\u00e9e, particuli\u00e8rement le domaine N-terminal intraluminal responsable de la fonction chaperonne. Pour accomplir leur fonction, calr\u00e9ticuline et calnexine fixent un \u00ab facteur de repliement \u00bb, une thiol oxydor\u00e9ductase baptis\u00e9e ERp57 (Endoplasmic Reticulum Protein<\/i> 57). Une peptidyl prolyl isom\u00e9rase (cyclophiline B) facilite le remodelage de l\u2019activit\u00e9 de certains polypeptides en facilitant la transition de la forme cis<\/i> \u00e0 la forme trans<\/i>. La glycoprot\u00e9ine correctement repli\u00e9e est lib\u00e9r\u00e9e des complexes avec la calnexine ou la calr\u00e9ticuline apr\u00e8s \u00e9limination du Glc interne restant par la glucosidase II. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Gelebart P, Opas M, Michalak M Calreticulin, a Ca2+-binding chaperone of the endoplasmic reticulum<\/i> (2005)
\nCoe H, Michalak M Calcium binding chaperones of the endoplasmic reticulum<\/i> (2009)
\nWada I, Rindress D, Cameron PH, Ou WJ, Doherty JJ 2nd, Louvard D, Bell AW, Dignard D, Thomas DY, Bergeron JJ SSR alpha and associated calnexin are major calcium binding proteins of the endoplasmic reticulum membrane<\/i> (1991)
\nOu WJ, Thomas DY, Bell AW, Bergeron JJ Casein kinase II phosphorylation of signal sequence receptor alpha and the associated membrane chaperone calnexin<\/i> (1992)
\nHochstenbach F, David V, Watkins S, Brenner MB Endoplasmic reticulum resident protein of 90 kilodaltons associates with the T- and B-cell antigen receptors and major histocompatibility complex antigens during their assembly<\/i> (1992)<\/span><\/p>\n

<\/a>Glycoprot\u00e9ines<\/b><\/span><\/h3>\n

Chez les eucaryotes, un tiers environ des prot\u00e9ines sont des glycoprot\u00e9ines. Elles sont omnipr\u00e9sentes dans les tissus animaux et v\u00e9g\u00e9taux, et chez les micro-organismes. Chez les mammif\u00e8res, tous les tissus et les liquides biologiques – plasma sanguin, lait, larmes, salive, urine – renferment des glycoprot\u00e9ines dont les oligosaccharides sont en majorit\u00e9 li\u00e9s \u00e0 N. Elles abondent dans la matrice extracellulaire, la membrane plasmique et les organites subcellulaires. Pour ne prendre que l\u2019exemple du noyau, elles sont pr\u00e9sentes dans l\u2019enveloppe et les pores nucl\u00e9aires, la chromatine, le nucl\u00e9ole, le nucl\u00e9oplasme\u2026 De m\u00eame pour les mitochondries, les lysosomes, les peroxysomes, le r\u00e9ticulum endoplasmique, le complexe de Golgi et le cytosquelette. Le cytosol contient peu de glycoprot\u00e9ines et leur glycane ne comporte qu\u2019une mol\u00e9cule de N-ac\u00e9tylglucosamine (GlcNAc) li\u00e9e \u00e0 un r\u00e9sidu s\u00e9rine ou thr\u00e9onine.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Bennet G, Hemming R, Lavoie PA Presence of glycoproteins in the cell nucleus as shown by autoradiographic studies after administration of (3H) fucose and (3H) galactose<\/i> (1986)
\nHart GW, Holt GD, Haltiwanger RS Nuclear and cytoplasmic glycosylation: novel saccharide linkages in unexpected places<\/i> (1988)
\nDavis LI, Blobel G Nuclear pore complex contains a family of glycoproteins that includes p62: glycosylation through a previously unidentified pathway<\/i> (1987)<\/span><\/p>\n

La d\u00e9couverte par Santiago Ramon y Cajal (Universit\u00e9 de Madrid) du lien entre Golgi et s\u00e9cr\u00e9tion fut largement confirm\u00e9e par les travaux du groupe de George Palade, au Rockefeller Institute<\/i>, sur la voie s\u00e9cr\u00e9toire dans les cellules des acini pancr\u00e9atiques. Des travaux ult\u00e9rieurs ont \u00e9tabli le lien entre Golgi et glycosylation des prot\u00e9ines. Les scientifiques engag\u00e9s dans ces recherches ont s\u00e9lectionn\u00e9 des cellules s\u00e9cr\u00e9trices comme mod\u00e8le exp\u00e9rimental. Les cellules caliciformes (goblet cells<\/i>), l\u2019un des quatre types de cellules de la muqueuse intestinale, r\u00e9pondent particuli\u00e8rement bien \u00e0 ce crit\u00e8re dans la mesure o\u00f9 elles fabriquent et exportent des glycoprot\u00e9ines \u00e0 longues cha\u00eenes d\u2019hydrate de carbones : les \u00ab mucines \u00bb, d\u00e9couvertes en 1914 par Ramon y Cajal. Elles forment une couche protectrice (cell coat<\/i>) \u00e0 la surface de la paroi intestinale et sont responsables du pouvoir lubrifiant du mucus. D\u2019une mani\u00e8re plus g\u00e9n\u00e9rale, les cellules des muqueuses et des \u00e9pith\u00e9liums sont prot\u00e9g\u00e9es et lubrifi\u00e9es par les mucoprot\u00e9ines (muco-polysaccharides) qu\u2019elles synth\u00e9tisent et s\u00e9cr\u00e8tent.<\/p>\n

A la diff\u00e9rence des cellules animale ou v\u00e9g\u00e9tale, la cellule bact\u00e9rienne est directement soumise aux variations de pression osmotique g\u00e9n\u00e9r\u00e9es par le milieu environnant ; aussi sont-elles entour\u00e9es d\u2019un filet de protection de peptidoglycanes. Chez les eubact\u00e9ries, les peptidoglycanes forment une structure macromol\u00e9culaire continue, pseudo cristalline, qui double la bicouche phospholipidique de la membrane plasmique. Les peptidoglycanes (mur\u00e9ines) sont form\u00e9s par l\u2019association de N-ac\u00e9tyl-glucosamine et d\u2019acide N-ac\u00e9tyl-muramique en longues s\u00e9quences lin\u00e9aires et r\u00e9p\u00e9titives. Ils sont interconnect\u00e9s par de courts peptides de trois \u00e0 cinq r\u00e9sidus d\u2019acides amin\u00e9s.<\/p>\n

<\/a>Complexe de Golgi : structure et fonction<\/b><\/span><\/h3>\n

\u00ab Chaque fois que nous entendrons dire : de deux choses l\u2019une, empressons-nous de penser que, de deux choses, c\u2019est vraisemblablement une troisi\u00e8me. \u00bb<\/i><\/p>\n

Jean Rostand<\/i><\/p>\n

Le complexe de Golgi est le compartiment central de la voie s\u00e9cr\u00e9toire. Il est travers\u00e9 par un intense trafic de v\u00e9sicules transportant des prot\u00e9ines, des lipides et des phospholipides de leur lieu de synth\u00e8se \u2013 le reticulum endoplasmique \u2013- vers le compartiment o\u00f9 ils exercent leur fonction : membrane plasmique (r\u00e9cepteurs hormonaux, transporteurs, canaux ioniques), endosomes, lysosomes (pompe \u00e0 protons, transporteurs, hydrolases), compartiment extracellulaire (o\u00f9 aboutissent la majorit\u00e9 des prot\u00e9ines synth\u00e9tis\u00e9es dans le reticulum). La s\u00e9cr\u00e9tion est un ph\u00e9nom\u00e8ne vital chez les \u00eatres vivants, des bact\u00e9ries \u00e0 l\u2019homme ; la plupart des cellules de mammif\u00e8res synth\u00e9tisent en permanence et lib\u00e8rent dans le milieu extracellulaire des peptides et des prot\u00e9ines n\u00e9cessaires \u00e0 la croissance (hormones), \u00e0 la digestion (zymog\u00e8nes), \u00e0 la transmission de l\u2019influx nerveux (neurotransmetteurs et autres messagers chimiques \u00e9tablissant la communication de cellule \u00e0 cellule), \u00e0 la r\u00e9gulation de la glyc\u00e9mie (insuline) et \u00e0 la d\u00e9fense immunitaire (antig\u00e8nes). La voie s\u00e9cr\u00e9toire a aussi pour fonction d\u2019ajuster en permanence la composition de la membrane plasmique par addition et retrait de lipides et de r\u00e9cepteurs prot\u00e9iques membranaires.<\/p>\n

C\u2019est au sein du Golgi que se font la glycosylation des prot\u00e9ines et des lipides mais, alors que les \u00e9tapes initiales dans le reticulum endoplasmique, la synth\u00e8se et le transfert du pr\u00e9curseur oligo mannosidique, sont tr\u00e8s conserv\u00e9es chez les eucaryotes, les \u00e9tapes ult\u00e9rieures dans le Golgi diff\u00e8rent selon les esp\u00e8ces : synth\u00e8se de glycanes polymannosyl\u00e9s chez les levures, de N-glycanes complexes chez les mammif\u00e8res, les plantes, les invert\u00e9br\u00e9s et les insectes. Ces modifications post-traductionnelles mettent en \u0153uvre plus de cent glycosyl-transf\u00e9rases diff\u00e9rentes. Le nombre \u00e9lev\u00e9 d\u2019enzymes s\u2019explique en partie par le fait qu\u2019ils sont sp\u00e9cifiques d\u2019une forme st\u00e9r\u00e9o-isom\u00e9rique des sucres, notamment des formes anom\u00e9riques \u03b1 ou \u03b2 (par r\u00e9f\u00e9rence \u00e0 la position du groupe OH par rapport au plan de la mol\u00e9cule) : il y a, par exemple, une GlcNAc \u03b2-1,4 galactosyl-transf\u00e9rase, une Gal \u03b1-1,3 galactosyl-transf\u00e9rase, une GlcNAc \u03b1-1,3 fucosyl-tranf\u00e9rase, une Gal \u03b1-1,2 fucosyl-tranf\u00e9rase. L\u2019acide sialique en p\u00e9riph\u00e9rie de la cha\u00eene oligosaccharidique est li\u00e9 \u00e0 un galactose par une liaison \u03b1\u22122,6 entre le C2 en conformation \u03b1 de l\u2019acide sialique et le C6 du galactose. L\u2019\u00e9lagage des sucres de la cha\u00eene oligosaccharidique mobilise des mannosidases, des glucosidases et d\u2019autres glycosydases. Le Golgi est \u00e9galement impliqu\u00e9 dans la sulfatation et la phosphorylation des prot\u00e9ines ; il renferme une sulfotransf\u00e9rase et une sulfatase . La premi\u00e8re catalyse l\u2019est\u00e9rification par un groupe sulfate de la fonction ph\u00e9nol des r\u00e9sidus tyrosine du fibrinog\u00e8ne, et la fonction alcool d\u2019un sucre dans les polyholosides comme les glycosaminoglycanes de la matrice extracellulaire. Le donneur de groupes sulfate est le phospho-ad\u00e9nosine phosphosulfate (PAPS). Le Golgi contient des phosphatases et des enzymes qui catalysent la synth\u00e8se, dans les cellules v\u00e9g\u00e9tales, d\u2019une vari\u00e9t\u00e9 de polysaccharides et des pectines ; il contient aussi des enzymes qui catalysent l\u2019acylation des prot\u00e9ines virales.<\/p>\n

A la fin des ann\u00e9es 1960, il \u00e9tait \u00e9tabli (i) que l\u2019\u00e9dification de la cha\u00eene oligosaccharidique des glycoprot\u00e9ines implique deux organites diff\u00e9rents : le reticulum endoplasmique et le complexe de Golgi et (ii) que l\u2019addition et la soustraction de sucres se fait de mani\u00e8re s\u00e9quentielle. La notion d\u2019une distribution non uniforme des enzymes dans le complexe de Golgi s\u2019est alors impos\u00e9e. Plusieurs approches exp\u00e9rimentales ont \u00e9t\u00e9 mises en \u0153uvre pour localiser les enzymes \u2013 glycosyl-transf\u00e9rases et glycosidases – entre le cis-Golgi, les citernes cis, m\u00e9dianes et trans du dichtyosome et le trans-Golgi : le fractionnement subcellulaire par centrifugation en gradient de densit\u00e9 a fourni peu d\u2019informations, \u00e0 l\u2019exception du travail de William G. Dunphy et James E. Rothman montrant des diff\u00e9rences de distribution des glycosyl-transf\u00e9rases dans les fractions.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Bergeron JJ, Ehrenreich JH, Siekevitz P, Palade GE Golgi fractions prepared from rat liver homogenates. II. Biochemical characterization<\/i> (1973)
\nMerrit WD, Morr\u00e9 DJ A glycosyltransferase of high specific activity in secretory vesicles from isolated Golgi apparatus of rat liver<\/i> (1973)
\nDunphy WG, Fries E, Urbani LJ, Rothman JE Early and late functions associated with the Golgi apparatus reside in distinct compartments<\/i> (1981)
\nRavoet AM, Amar-Costesec A, Beaufay H Topology of Mannosyltransferase, Glucosyltransferase and N-acetylglucosamine Phosphotransferase in rat liver<\/i> (1982)
\nDunphy WG, Rothman JE Compartmentation of asparagine-linked oligosaccharide processing in the Golgi apparatus<\/i> (1983) <\/span><\/p>\n

Les r\u00e9sultats de la cytochimie ou de l\u2019immunomicroscopie \u00e9lectronique avec des anticorps marqu\u00e9s ont r\u00e9v\u00e9l\u00e9 des diff\u00e9rences de localisation des phosphatases. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Clermont Y, Lalli M, Rambourg A Ultrastructural localization of nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase (NADPase), thiamine pyrophosphatase (TPPase), and cytidine monophosphatase (CMPase) in the Golgi apparatus of early spermatids of the rat<\/i> (1981)
\nRoth J, Berger EG Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae<\/i> (1982)
\nSinowatz F, Amselgruber W Cytochemical localization of nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase (NADPase) in bovine Leydig cells<\/i> (1986)
\nVelasco A, Hidalgo J Cytochemical localization of thiamine pyrophosphatase and nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase activities in rat epiphyseal chondrocytes<\/i> (1987)
\nDunphy WG, Brands R, Rothman JE Attachment of terminal N-acetylglucosamine to asparagine-linked oligosaccharides occurs in central cisternae of the golgi stack<\/i> (1985) <\/span><\/p>\n

Enfin, des r\u00e9sultats significatifs ont \u00e9t\u00e9 obtenus sur la localisation des glycosyl-transf\u00e9rases par marquage avec des anticorps fluorescents et microscopieconfocale \u00e0 balayage laser. La dissection biochimique, g\u00e9n\u00e9tique et microscopique de la fonction des 23 g\u00e8nes SEC de Saccharomyces cerevisiae<\/i> (Peter Novick et Randy Scheckman, Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley<\/i>) a apport\u00e9 des informations essentielles sur la machinerie mol\u00e9culaire de la voie s\u00e9cr\u00e9toire. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Berger EG, Thurnher M, M\u00fcller U Galactosyltransferase and sialyltransferase are located in different subcellular compartments in HeLa cells<\/i> (1987)
\nBerger EG, Grimm K, B\u00e4chi T, Bosshart H, Kleene R, Watzele M Double immunofluorescent staining of alpha 2,6 sialyltransferase and beta 1,4 galactosyltransferase in monensine-treated cells: evidence of different Golgi compartments? <\/i> (1987) <\/span><\/p>\n

Le tableau suivant est un r\u00e9sum\u00e9 des r\u00e9sultats obtenus : <\/p>\n\n\n\n
 \"chap7-3\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

Le tableau ci-dessous montre la s\u00e9quence, de haut en bas, des r\u00e9actions catalys\u00e9es par les glycosyl-transf\u00e9rases : <\/p>\n\n\n\n
 \"chap7-4\"<\/a><\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n

Note: La premi\u00e8re \u00e9tape de la biosynth\u00e8se des cha\u00eenes glycaniques dans le reticulum endoplasmique : le transfert de GlcNAc-1-P de l\u2019UDP-GlcNAc sur le dolichol phosphate, par la GlcNAc-phosphotransf\u00e9rase, est inhib\u00e9e par la tunicamycine, un antibiotique nucl\u00e9osidique. Les glycosidases effectuent des coupures dans la cha\u00eene oligosaccharidique en fonction de sa composition en sucres, qui varie d\u2019un compartiments \u00e0 l\u2019autre du Golgi. Le transfert de fucose sur la N-ac\u00e9tylglucosamine li\u00e9e \u00e0 l\u2019asparagine de la cha\u00eene polypeptidique est catalys\u00e9e par la GlcNAc \u03b1-1,3 fucosyl-tranf\u00e9rase. <\/span><\/p>\n

Les images tridimensionnelles obtenues par tomographie microscopique montrent la complexit\u00e9 et le polymorphisme du Golgi : sa forme varie d\u2019un type cellulaire \u00e0 l\u2019autre : des citernes de forme ovale agenc\u00e9es en panier (cellules \u00e9pith\u00e9liales du canal de l\u2019\u00e9pididyme), un r\u00e9seau de rubans allong\u00e9s (cellules des acini pancr\u00e9atiques), une cage sph\u00e9rique (cellules s\u00e9cr\u00e9toires de l\u2019hypophyse ant\u00e9rieure). Dans les cellules animales et v\u00e9g\u00e9tales, le nombre de saccules par dichtyosome et le nombre de dichtyosomes par cellule sont variables. Aussi spectaculaires soient-elles, les reconstitutions tridimensionnelles ne rendent pas compte du caract\u00e8re dynamique du Golgi. Seules des \u00e9tudes sur cellules vivantes permettent d\u2019aborder cette question. L\u2019emploi de cargos marqu\u00e9s avec la prot\u00e9ine verte fluorescente ont permis l\u2019observation au microscope des mouvements des tubules et v\u00e9sicules d\u2019un compartiment cellulaire \u00e0 l\u2019autre. Des am\u00e9liorations techniques ont marqu\u00e9 le passage \u00e0 une morphologie quantitative<\/b> : la mesure de la fluorescence \u00e9mises par les chim\u00e8res de prot\u00e9ines solubles ou membranaires avec la prot\u00e9ine verte fluorescente donne une \u00e9valuation du nombre de mol\u00e9cules transport\u00e9es et permet d\u2019\u00e9tablir les param\u00e8tres cin\u00e9tiques du transport dans la voie s\u00e9cr\u00e9toire. Un double marquage avec des prot\u00e9ines vertes fluorescentes avec des spectres d\u2019excitation\/\u00e9mission diff\u00e9rents ouvre la possibilit\u00e9 de comparer le sort de deux cargo prot\u00e9iques. <\/p>\n

Pour rendre compte des donn\u00e9es exp\u00e9rimentales sur le fonctionnement de la voie s\u00e9cr\u00e9toire, deux mod\u00e8les ont \u00e9t\u00e9 propos\u00e9s. (i) Le Golgi est un organite dynamique. La premi\u00e8re citerne (cis-Golgi, ERGIC ER-Golgi intermediate compartment<\/i>) se forme par agr\u00e9gation et fusion de v\u00e9sicules issues de domaines sp\u00e9cialis\u00e9s du reticulum endoplasmique et enfermant le cargo prot\u00e9ique. Cette citerne et son cargo entreprennent une migration ant\u00e9rograde. Sa composition en prot\u00e9ines r\u00e9sidentes se modifie au fur et \u00e0 mesure de sa progression vers le trans-Golgi. Un flux r\u00e9trograde de v\u00e9sicules r\u00e9tablit la sp\u00e9cificit\u00e9 de chaque compartiment en renvoyant des prot\u00e9ines vers le compartiment en amont et en ajoutant de nouvelles, fournies par le compartiment en aval. La citerne trans ach\u00e8ve sa maturation en devenant le trans-Golgi, qui donne naissance aux v\u00e9sicules s\u00e9cr\u00e9toires. Le mod\u00e8le de maturation des citernes<\/b> (Cisternal maturation model<\/i>) est essentiellement bas\u00e9 sur des donn\u00e9es de microscopie tridimensionnelle sur cellules vivantes, avec prises d\u2019images en acc\u00e9l\u00e9r\u00e9 (three-dimensional time-lapse microscopy<\/i>). L\u2019hypoth\u00e8se de la maturation membranaire (flow differentiation<\/i>) avait \u00e9t\u00e9 formul\u00e9e dans les ann\u00e9es 1960 par Hilton Mollenhauer, W Gordon Whaley et James D. Morr\u00e9 (The Plant Research Institute, The University of Texas, Austin<\/i>). <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Mollenhauer HH, Whaley WG An observation on the functioning of the Golgi apparatus<\/i> (1963)
\nMironov AA, Mironov Jr AA, Beznoussenko GV, Trucco A, Lupetti P, Smith JD, Geerts WJC, Koster AJ, Burger KNJ, Martone ME, Deerinck TJ, Ellisman MH, Luini A ER-to-Golgi carriers arise through direct en bloc protrusion and multistage maturation of specialized ER exit domains<\/i> (2003)
\nMorr\u00e9 DJ, Mollenhauer HH Microscopic morphology and the origins of the membrane maturation model of Golgi apparatus function<\/i> (2007) <\/span><\/p>\n

Le mod\u00e8le morphologique du transport v\u00e9siculaire<\/b> (Stable compartment model<\/i>) fut propos\u00e9 dans les ann\u00e9es 1980. Le Golgi est un organite statique, stabilis\u00e9 par ses liaisons avec le cytosquelette. Au cours du transport du cargo, l\u2019\u00e9quipement enzymatique sp\u00e9cifique des citernes est conserv\u00e9. Le d\u00e9placement ant\u00e9rograde du cargo, d\u2019une citerne \u00e0 la suivante, est assur\u00e9 par des navettes de v\u00e9sicules jusqu\u2019au trans-golgi ; les prot\u00e9ines membranaires golgiennes impliqu\u00e9es dans le trafic sont ramen\u00e9es \u00e0 leur saccule d\u2019origine par des v\u00e9sicules se d\u00e9pla\u00e7ant dans le sens r\u00e9trograde. Aucun des deux mod\u00e8les n\u2019est en mesure de rendre compte de la totalit\u00e9 des faits. Chaque mod\u00e8le est en accord avec un certain nombre d\u2019observations et en contradiction avec d\u2019autres : par exemple, le fait que des cargos de diff\u00e9rentes tailles ou natures ne se d\u00e9placent pas \u00e0 la m\u00eame vitesse dans le Golgi. Les deux mod\u00e8les ne s\u2019excluent pas totalement l\u2019un l\u2019autre ; on pourrait imaginer une coexistence des deux m\u00e9canismes avec un transport ant\u00e9rograde par migration de citernes et un transport r\u00e9trograde par v\u00e9sicules. <\/p>\n

Dans une variante du mod\u00e8le de progression et maturation des citernes un r\u00f4le est attribu\u00e9 aux connections tubulaires entre citernes \u2013 visibles dans les structures tridimensionnelles. Ces connexions joueraient un r\u00f4le dans le trafic bidirectionnel. Un mod\u00e8le r\u00e9cent fait intervenir des prot\u00e9ines monom\u00e9riques G (Rab), li\u00e9es aux membranes par un groupe pr\u00e9nyl. Les Rab sont des GTPases appartenant \u00e0 la super famille des proto-oncog\u00e8nes Ras. Ces mol\u00e9cules r\u00e9gulatrices et ubiquitaires interviennent (avec d\u2019autres facteurs) dans tous les trafics intracellulaires entre compartiments membranaires : s\u00e9lection du cargo, formation des v\u00e9sicules \u00e0 partir du compartiment donneur, fusion avec la membrane du compartiment receveur. La voie biosynth\u00e9tique de certaines prot\u00e9ines \u00e9vite le passage oblig\u00e9 par la voie s\u00e9cr\u00e9toire classique ; elles transitent directement du r\u00e9ticulum endoplasmique vers la membrane plasmique en court-circuitant le complexe de Golgi et en l\u2019absence de v\u00e9sicules COP fonctionnelles : HSP 150, une prot\u00e9ine de choc thermique O-glycosyl\u00e9e de la levure Saccharomyces cerevisiae<\/i>, invertase, Voltage-gated K+<\/sup> channel<\/i> et la prot\u00e9ine r\u00e9gulatrice Kv Channel Interacting Protein<\/i> de l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 dendritique des neurones. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Suntio T, Shmelev A, Lund M, Makarow M The sorting determinant guiding Hsp 150 to the COPI-independent transport pathway in yeast<\/i> (1999)
\nFoeger NC, Marionneau C, Nerbonne JM Co-assembly of Kv4 {alpha} subunits with K+ channel-interacting protein 2 stabilizes protein expression and promotes surface retention of channel complexes<\/i> (2010) <\/span><\/p>\n

<\/a>Trafic v\u00e9siculaire<\/b><\/span><\/h3>\n

Les v\u00e9sicules sont les \u00e9l\u00e9ments fonctionnels de l\u2019intense trafic, \u00e9voqu\u00e9 au d\u00e9but du paragraphe pr\u00e9c\u00e9dent, et qui se d\u00e9roule entre le reticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Le trafic v\u00e9siculaire est essentiel pour maintenir la structure et la fonction des organites, et donc l\u2019existence de la cellule ; il soul\u00e8ve au moins trois questions : (i) comment se forment les v\u00e9sicules et la s\u00e9lection du cargo \u00e0 partir de l\u2019organite donneur ? (ii) comment les v\u00e9sicules issues d\u2019un compartiment donneur trouvent-elles l\u2019organite accepteur ? (iii) comment s\u2019op\u00e8re la fusion de la v\u00e9sicule avec la membrane de l\u2019organite accepteur ? <\/p>\n

Le transport met en jeu des v\u00e9sicules tapiss\u00e9es de cotam\u00e8res, COPI et COPII et des v\u00e9sicules tapiss\u00e9es de clathrine<\/u>. Les v\u00e9sicules COP (Coat Protein<\/i>) ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9couvertes parmi les prot\u00e9ines cod\u00e9es par les g\u00e8nes SEC de la levure Saccharomyces cerevisiae<\/i>. Les v\u00e9sicules COPII assurent le transport ant\u00e9rograde du reticulum endoplasmique rugueux vers le cis-Golgi et du cis-Golgi vers le trans-Golgi. La fonction des v\u00e9sicules COPI (Coat Protein complex I<\/i>) a longtemps \u00e9t\u00e9 d\u00e9battue ; on leur a d\u2019abord attribu\u00e9 un r\u00f4le dans le transport ant\u00e9rograde du cargo. Leur r\u00f4le dans le transport r\u00e9trograde du cis-Golgi vers le reticulum endoplasmique a \u00e9t\u00e9 d\u00e9couvert en 1996 par Randy W. Schekman (University of California, Berkeley<\/i>), et par Lelio Orci et coll. (D\u00e9partement de morphologie, Universit\u00e9 de Gen\u00e8ve). Le transport r\u00e9trograde remplit deux fonctions : (i) maintenir l\u2019\u00e9quipement enzymatique et les capacit\u00e9s biosynth\u00e9tiques du compartiment donneur ; les donn\u00e9es exp\u00e9rimentales montrent que ce c\u2019est le cas alors qu\u2019il \u00e9merge continuellement du compartiment donneur des v\u00e9sicules destin\u00e9es au compartiment accepteur (ii) renvoyer vers le reticulum endoplasmique les prot\u00e9ines mal form\u00e9es ayant \u00e9chapp\u00e9 \u00e0 la sanction du contr\u00f4le de qualit\u00e9. Ces prot\u00e9ines doivent \u00eatre \u00e9limin\u00e9es car elles repr\u00e9sentent un risque potentiel pour la survie de la cellule qu\u2019il existe un double contr\u00f4le de qualit\u00e9, dans le reticulum endoplasmique et dans le complexe de Golgi. Je traiterai plus loin de la fonction des v\u00e9sicules \u00e0 clathrine. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Oka T, Nakano A Inhibition of GTP hydrolysis by Sar1p causes accumulation of vesicles that are a functional intermediate of the ER-to-Golgi transport in yeast<\/i> (1994)
\nYamanushi T, Hirata A, Oka T, Nakano A Characterization of yeast sar1 temperature-sensitive mutants, which are defective in protein transport from the endoplasmic reticulum<\/i> (1996)
\nSaito Y, Kimura K, Oka T, Nakano A Activities of mutant Sar1 proteins in guanine nucleotide binding, GTP hydrolysis, and cell-free transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus<\/i> (1998) <\/span><\/p>\n

La membrane des v\u00e9sicules COP est une bicouche phospholipidique dans laquelle sont ins\u00e9r\u00e9es trois types de prot\u00e9ines int\u00e9grales : (i) enzymes destin\u00e9s au Golgi, prot\u00e9ines (r\u00e9cepteurs) destin\u00e9es \u00e0 la membrane plasmique, prot\u00e9ines (r\u00e9cepteurs) destin\u00e9es aux endosomes\/lysosomes ; (ii) r\u00e9cepteurs du cargo \u00ab soluble \u00bb (r\u00e9cepteurs KDEL, le motif d\u2019adressage des prot\u00e9ines r\u00e9sidentes du reticulum endoplasmique) ; (iii) prot\u00e9ines de fusion membranaire (vSNARE). Les v\u00e9sicules sont entour\u00e9es d\u2019une enveloppe form\u00e9e d\u2019un complexe prot\u00e9ique, le cotam\u00e8re ; l\u2019enveloppe des v\u00e9sicules COPI est form\u00e9e d\u2019heptam\u00e8res COP 1 (Coat Protein<\/i> de type 1) ; l\u2019enveloppe des v\u00e9sicules COPII, d\u2019heptam\u00e8res COP 2 (Coat Protein<\/i> de type 2). <\/p>\n

Les v\u00e9sicules COP prennent naissance \u00e0 partir de la membrane des domaines lisse ou ribosomial du reticulum endoplasmique, au niveau de sites de sortie (exit sites<\/i>). L\u2019int\u00e9racation d\u2019une v\u00e9sicule avec une membrane, que ce soit sa membrane d\u2019origine ou sa membrane cible, implique une d\u00e9sorganisation localis\u00e9e de la bicouche phospholipidique. Sur la membrane du reticulum endoplasmique cette fonction est assur\u00e9e par une h\u00e9lice \u03b1 amphipathique de petites GTPases ; en ins\u00e9rant sa face hydrophobe dans le feuillet cytoplasmique de la bicouche phospholipidique, elle induit une asym\u00e9trie entre les deux feuillets, et une courbure de la membrane. Sur la membrane cible (le cis-Golgi), elle met en jeu une h\u00e9lice \u03b1 de 20 \u00e0 40 r\u00e9sidus d\u2019acides amin\u00e9s, l\u2019Amphipathic Lipid Packing Sensor<\/i>. Le motif ALPS a \u00e9t\u00e9 d\u00e9couvert en 2005, \u00e0 l\u2019extr\u00e9mit\u00e9 N-terminale d\u2019une prot\u00e9ine r\u00e9gulatrice de l\u2019activit\u00e9 des GTPases (Arf GTPase-Activating Protein 1<\/i>). Son affinit\u00e9 pour les membranes pr\u00e9sentant une courbure a \u00e9t\u00e9 \u00e9tudi\u00e9e, en particulier par Jo\u00eblle Bigay et coll. (Universit\u00e9 C\u00f4te d\u2019Azur). Le cargo fait l\u2019objet d\u2019une s\u00e9lection, comme on a pu le d\u00e9montrer avec un mat\u00e9riel suffisamment volumineux pour \u00eatre visible en microscopie \u00e9lectronique, et suivi chronologiquement. La s\u00e9lection s\u2019op\u00e8re par interactions prot\u00e9ine-prot\u00e9ine du type ligand-r\u00e9cepteur, entre des r\u00e9cepteurs de la membrane et des prot\u00e9ines du r\u00e9ticuloplasme. De plus, l\u2019insertion des GTPases provoque une curvature de la membrane ; le bourgeonnement est accentu\u00e9 par la polym\u00e9risation du cotam\u00e8re, comme on a pu le montrer par microscopie \u00e9lectronique pour le cotam\u00e8re COPI ; ce dernier interagit sp\u00e9cifiquement avec des prot\u00e9ines et les concentre dans le bourgeon. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Zeuschner D, Geerts WJ, van Donselaar E, Humbel BM, Slot JW, Koster AJ, Klumperman J Immuno-electron tomography of ER exit sites reveals the existence of free COPII-coated transport carriers<\/i> (2006)
\nBigay J, Casella JF, Drin G, Mesmin B, Antonny B ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif<\/i> (2005)
\nDrin G, Casella JF, Gautier R, Boehmer T, Schwartz TU, Antonny B A general amphipathic alpha-helical motif for sensing membrane curvature<\/i> (2007)
\nVanni S, Vamparys L, Gautier R, Drin G, Etchebest C, Fuchs PF, Antonny B (2013) Amphipathic Lipid Packing Sensor Motifs: Probing Bilayer Defects with Hydrophobic Residues<\/i> (2013) <\/span><\/p>\n

Dans les ann\u00e9es 1980, James Rothman (Department of Cellular Biochemistry and Biophysics Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York<\/i>) mit en \u00e9vidence le transport v\u00e9siculaire en syst\u00e8me acellulaire. Il pr\u00e9para une fraction membranaire enrichie en \u00e9l\u00e9ments du Golgi \u00e0 partir de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary cell line<\/i>), souvent utilis\u00e9e pour les recherches en g\u00e9n\u00e9tique (existence de mutants). Il suivit le sort de la glycoprot\u00e9ine G-VSVentre un compartiment donneur : des citernes golgiennes d\u2019une lign\u00e9e cellulaire d\u00e9ficiente en N-ac\u00e9tylglucosaminyl-transf\u00e9rase, et un compartiment receveur : les citernes golgiennes de la lign\u00e9e sauvage. Le passage de la glycoprot\u00e9ine G-VSV d\u2019un compartiment \u00e0 l\u2019autre se traduisait par l\u2019incorporation de 3<\/sup>H-N-ac\u00e9tylglucosamine. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Balch WE, Dunphy WG, Braell WA, Rothman JE Reconstitution of the transport of protein between successive compartments of the Golgi measured by the coupled incorporation of N-acetylglucosamine<\/i> (1984)
\nBalch WE, Rothman JE Characterization of protein transport between successive compartments of the Golgi apparatus: Asymmetric properties of donor and acceptor activities in a cell-free system<\/i> (1985)
\nRothman JE, Orci L Movement of proteins through the Golgi stack: a molecular dissection of vesicular transport<\/i> (1990)<\/span><\/p>\n

En 1988, Vivek Malhotra et coll montr\u00e8rent que le transport \u00e0 travers le Golgi met en jeu un facteur sensible \u00e0 la N-\u00e9thyl-mal\u00e9imide. Pour rappel, la N-\u00e9thyl-mal\u00e9imide est un oxydant et un inhibiteur des ATPases. Le N-ethylmaleimide sensitive factor<\/i> (NSF) est une prot\u00e9ine cytosolique. Dans un milieu d\u2019incubation contenant du Golgi, du cytosol et de l\u2019ATP on observe, en l\u2019absence de ce facteur, une accumulation de v\u00e9sicules \u00ab nues \u00bb, sans enveloppe. Le NSF s\u2019associe \u00e0 d\u2019autres prot\u00e9ines cytosoliques : les Soluble NSF Attachment Proteins<\/i> (\u03b1-SNAP, \u03b2-SNAP, \u03b3-SNAP) que Douglas O. Clary et coll. ont purifi\u00e9es \u00e0 partir de cytosol de cerveau de b\u0153uf. Les SNAP sont tr\u00e8s conserv\u00e9es parmi les esp\u00e8ces ; on les retrouve dans le cytosol de levure. James E. Rothman interpr\u00e9ta la formation du complexe membranaire SNAP-NSF comme \u00e9tant l\u2019amorce d\u2019une \u00ab machinerie de fusion \u00bb multim\u00e9rique, n\u00e9cessaire au transport v\u00e9siculaire. Les r\u00e9sultats des exp\u00e9riences ult\u00e9rieures ont apport\u00e9 la preuve que NSF et SNAPs sont les composants essentiels et universels de l\u2019appareil de fusion membranaire, que la fusion soit \u00ab constitutive \u00bb ou r\u00e9gul\u00e9e, comme dans le cas de la lib\u00e9ration de neurotransmetteurs.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Malhotra V, Orci L, Glick BS, Block MR, Rothman JE Role of an N-ethylmaleimide-sensitive transport component in promoting fusion of transport vesicles with cisternae of the Golgi stack<\/i> (1988)
\nWilson DW, Whiteheart SW, Widemann M, Brunner M Rothman JE A Multisubunit Particule Implicated in Membrane Fusion<\/i> (1992)<\/span><\/p>\n

L\u2019enveloppe des v\u00e9sicules COP est assembl\u00e9e \u00e0 partir de facteurs recrut\u00e9s dans le cytosol et, en premier lieu, des GTPases. Il existe un th\u00e8me g\u00e9n\u00e9ral commun \u00e0 la formation de tous les types de v\u00e9sicules ; elle d\u00e9bute par l\u2019activation d\u2019une prot\u00e9ine \u00e0 GTP : Sar1 (Secretion Associated Ras-superfamily gene 1<\/i>) chez la levure ou ARF (ADP Ribosylation Factor<\/i>) chez les mammif\u00e8res. Ces deux facteurs appartiennent \u00e0 la superfamille des prot\u00e9ines RAS (RAt Sarcoma<\/i>), des guanosine triphosphatase de petites taille, activ\u00e9es par des facteurs d\u2019\u00e9change de guanine (Guanine exchange factor, GTPase-activating proteins<\/i>). Les prot\u00e9ines RAS ont \u00e9t\u00e9 d\u00e9couvertes au d\u00e9but des ann\u00e9es 1980 dans le g\u00e9nome humain par Edward M. Scolnick et coll., lors d\u2019\u00e9tudes sur les virus canc\u00e9rig\u00e8nes isol\u00e9s dans les ann\u00e9es 1960 par Jennifer Harvey et Werner Kirsten (Harvey<\/i> et Kirsten murine sarcoma viruses<\/i>). Les cinq principales familles \u2013 Rab, Ran, Ras, Rho, Arf – diff\u00e8rent les unes des autres par des diff\u00e9rences de structure. Elles r\u00e9gulent le trafic dans tous les compartiments de la cellule. Certaines, comme Rab1 (Rat Brain 1<\/i>) sont li\u00e9es aux membranes par un groupement g\u00e9ranylg\u00e9ranyle. Leur activit\u00e9 est soumise \u00e0 une r\u00e9gulation positive par les Guanine nucleotide exchange factor<\/i> et \u00e0 une r\u00e9gulation n\u00e9gative par les GTPase-activating proteins<\/i> ; elles passent de la forme inactive Sar1-GDP \u00e0 la forme active Sar1-GTP ; de m\u00eame pour ARF : ARF-GDP (forme inactive) – ARF-GTP (forme active). Prenons l\u2019exemple de la prot\u00e9ine G Arf1 : elle est activ\u00e9e par l\u2019Arf GAP1 (ADP Ribosylation Factor GTPase Activating Protein 1<\/i>) son facteur d\u2019\u00e9change (GBF1) localis\u00e9 au cis<\/i>-Golgi. Arf1, li\u00e9 \u00e0 la membrane de la v\u00e9sicule en formation, recrute un complexe soluble constitu\u00e9 de sept sous-unit\u00e9s, le cotam\u00e8re. La structure tridimensionnelle d\u2019un complexe de recrutement (Sar1-GTP, Sec23\/24) a \u00e9t\u00e9 \u00e9lucid\u00e9e par cristallographie aux rayons X.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Chang EH, Gonda MA, Ellis RW, Scolnick EM, Lowy DR Human genome contains four genes homologous to transforming genes of Harvey and Kirsten murine sarcoma viruses<\/i> (1982)
\nMelan\u00e7on P, Glick BS, Malhotra V, Weidman PJ, Serafin T, Orci L, Rothman JE A role for GTP-binding proteins in vesicular transport through the Golgi complex<\/i> (1989)
\nSerafini, T, Orci L, Amherdt M, Brunner M, Kahn RA, Rothman JE ADP-Ribosylation Factor is a Subunit of the coat of Golgi-derived COP-coated vesicles: a novel role for a GTP-binding protein<\/i> (1991)
\nBarlowe C, Orci L, Yeung T, Hosobuchi M, Hamamoto S, Salama N, Rexach MF, Ravazzola M, Amherdt M, Schekman R COPII: a membrane coat formed by Sec proteins that drive vesicle budding from the endoplasmic reticulum<\/i> (1994)
\nYamanushi T, Hirata A, Oka T, Nakano A Characterization of yeast sar1 temperature-sensitive mutants, which are defective in protein transport from the endoplasmic reticulum<\/i> (1996)
\nKuehn MJ, Herrmann JM, Schekman R COPII-cargo interactions direct protein sorting into ER-derived transport vesicles<\/i> (1998)
\nBi X, Corpina RA, Goldberg J Structure of the Sec23\/24\u2013Sar1 pre-budding complex of the COPII vesicle coat<\/i> (2002)
\nStenmark H Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic<\/i> (2009)<\/span><\/p>\n

Les v\u00e9sicules ayant s\u00e9lectionn\u00e9 le cargo au niveau des sites de sortie (ERES, ER Exit Sites<\/i>) de la membrane du reticulum endoplasmique accostent sur la membrane du cis-Golgi et les membranes de la v\u00e9sicule et de la citerne-cible fusionnent. C\u2019est \u00e0 ce stade qu\u2019interviennent les r\u00e9cepteurs membranaires du complexe NSF-SNAP : les SNAP receptors<\/i> (SNARE, Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor<\/i>) ; ils ont \u00e9t\u00e9 isol\u00e9s \u00e0 partir d\u2019un extrait de cerveau. Les neurones sont un mod\u00e8le pour l\u2019\u00e9tude des SNARE. Dans le cerveau, de nombreux processus mettent en jeu des fusions membranaires : la lib\u00e9ration des neurotransmetteurs met en jeu la fusion les v\u00e9sicules synaptiques avec la membrane plasmique. Plusieurs membres de la famille des SNARE ont \u00e9t\u00e9 identifi\u00e9s \u00e0 partir de la membrane plasmique neuronale : la synaptobr\u00e9vine (VAMP, Vesicle Associated Membrane Protein<\/i>), la syntaxine et la prot\u00e9ine synaptosomale de 25 kDa (SNAP-25, SyNaptosomal Associated Protein of 25 kDa<\/i>). La synaptobr\u00e9vine est un moteur mol\u00e9culaire v\u00e9siculaire (v-SNARE) ; la syntaxine et SNAP-25 sont des moteurs mol\u00e9culaires de la membrane cibles ( target<\/i>, t-SNARE). Les membres de la superfamille SNARE jouent un r\u00f4le clef dans la reconnaissance et la fusion des v\u00e9sicules ; l\u2019interaction v-SNARE – t-SNARE permet de vaincre la barri\u00e8re \u00e9nerg\u00e9tique emp\u00eachant la fusion spontan\u00e9e des membranes. La s\u00e9quence et la structure tridimensionnelle des SNARE des v-SNARE – riches en arginine – et des t-SNARE – riches en glutamine – sont conserv\u00e9es parmi les esp\u00e8ces.<\/p>\n

L\u2019existence de l\u2019enveloppe des v\u00e9sicules est transitoire. Dans les v\u00e9sicules COPI, une GAP (GTPase Activating Protein<\/i>), l\u2019Arf GAP1 (Arf GTPase Activating Protein<\/i>) d\u00e9sactive Arf1 en hydrolysant le GTP ; la d\u00e9polym\u00e9risation du manteau d\u00e9masque les prot\u00e9ines impliqu\u00e9es dans la fusion. Il s\u2019agit de mol\u00e9cules allong\u00e9es, riches en h\u00e9lices \u03b1. Lors de la fusion, les prot\u00e9ines SNARE se transforment en une configuration ternaire extr\u00eamement stable, un enroulement en superh\u00e9lice (coiled coil<\/i>) g\u00e9n\u00e9ralement compos\u00e9 de v-SNARE, de la synaptobr\u00e9vine (VAMP), de t-SNARE, de syntaxine et de SNAP-25. La formation de ce complexe conduit \u00e0 la fusion des membranes, entra\u00eenant la lib\u00e9ration du cargo de la v\u00e9sicule. Les prot\u00e9ines solubles sont d\u00e9vers\u00e9es dans l\u2019espace luminal ou \u00e0 l\u2019ext\u00e9rieur de la cellule et les prot\u00e9ines membranaires sont ins\u00e9r\u00e9es dans la membrane du compartiment accepteur. Le recyclage de la machinerie SNARE commence lorsque l’\u03b1-SNAP et le NSF se lient \u00e0 la syntaxine et au SNAP-25. James Rothman et Randy Schekman ont partag\u00e9 le prix Nobel de m\u00e9decine ou physiologie 2013 pour leur contribution au d\u00e9chiffrage du m\u00e9canisme du trafic v\u00e9siculaire et \u00e0 l\u2019identification des principaux acteurs. Le troisi\u00e8me co-titulaire du prix \u00e9tait Thomas S\u00fcdhof (Stanford University, Palo Alto<\/i>).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Clary DO, Rothman JE Purification of three related peripheral membrane proteins needed for vesicular transport<\/i> (1990)
\nClary DO, Griff IC, Rothman JE SNAPs, a family of NSF attachment proteins involved in intracellular membrane fusion in animals and yeast<\/i> (1990)
\nS\u00f6llner T, Whiteheart SW, Brunner M, Erdjument-Bromage H, Geromanos S, Tempst P, Rothman JE SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion<\/i> (1993)
\nSutton RB, Fasshauer D, Jahn R, Brunger AT Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 angstrom resolution<\/i> (1998)
\nSutton RB, Fasshauer D, Jahn R, Brunger AT Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4 A resolution<\/i> (1998)
\nWeiss WI, Scheller RH Membrane fusion. SNARE the rod, coil the complex<\/i> (1998)
\nNickel W, Weber T, McNew JA, Parlati F, Sollner TH, Rothman JE Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs<\/i> (1999)
\nMcNew JA, Parlati F, Fukuda R, Johnston RJ, Paz K, Paumet F, S\u00f6llner TH, Rothman JE Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins<\/i> (2000)
\nLittleton JT, Barnard RJO, Titus SA, Slind J, Chapman ER, Ganetzky B Snare complex disassembly by NSF follows synaptic vesicle fusion<\/i> (2001)
\nWeber T, Zemelman BV, McNew JA, Westermann B, Gmachi M, Parlati F, S\u00f6llner TH, Othman JE SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion<\/i> (1998)
\nAntonin W, Fasshauer D, Becker S, Jahn R, Schneider TR Crystal structure of the endosomal SNARE complex reveals common structural principles of all SNAREs<\/i> (2002)
\nBigay J, Gounon P, Robineau S, Antonny B Lipid packing sensed by ArfGAP1 couples COPI coat disassembly to membrane bilayer curvature<\/i> (2003)<\/span><\/p>\n

Dans le sch\u00e9ma classique de la voie s\u00e9cr\u00e9toire, le cis-Golgi est plac\u00e9 imm\u00e9diatement en aval du reticulum endoplasmique. On distingue maintenant un compartiment interm\u00e9diaire (ERGIC, ER Golgi Intermediate Compartment<\/i>) ; il a fait l\u2019objet d\u2019\u00e9tudes par le groupe de Hans-Peter Hauri (Biozentrum, Universit\u00e4t Basel<\/i>) sur cellules d\u2019h\u00e9patome humain HepG2, par immuno-microscopie en fluorescence. Bien que l\u2019on ait d\u00e9crit l\u2019existence d\u2019interconnections tubulaires, il semble \u00e9tabli que la formation du compartiment ERGIC soit le r\u00e9sultat de la coalescence de v\u00e9sicules (VTC, Vesicular Tubular Cluster<\/i>) sous le contr\u00f4le des petites GTPases Rab et Arf et impliquant les SNAREs. Les v\u00e9sicules COPII, provenant des sites de sortie du reticulum endoplasmique (ER-exit sites<\/i>), assurent le transport ant\u00e9rograde du cargo vers le compartiment interm\u00e9diaire ; le compartiment ERGIC est aussi aliment\u00e9 par le transport r\u00e9trograde de v\u00e9sicules en provenance du Golgi. La lectine ERGIC-53 reconnait les groupes mannosyl des glycoprot\u00e9ines et participe au contr\u00f4le de qualit\u00e9.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Hauri HP, Schweizer A The endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment<\/i> (1997)
\nKlumperman J, Schweizer A, Clausen H, Tang BL, Hong W, Oorschot V, Hauri HP The recycling pathway of protein ERGIC-53 and dynamics of the ER-Golgi intermediate compartment<\/i> (1998)
\nMoussalli M, Pipe SW, Hauri HP, Nichols WC, Ginsburg D, Kaufman RJ Mannose-dependent endoplasmic reticulum (ER)-Golgi intermediate compartment-53-mediated ER to Golgi trafficking of coagulation factors V and VIII<\/i> (1999)
\nMironov AA, Mironov AA Jr, Beznoussenko GV, Trucco A, Lupetti P, Smith JD, Geerts WJ, Koster AJ, Burger KN, Martone ME, Deerinck TJ, Ellisman MH, Luini A ER-to-Golgi carriers arise through direct en bloc protrusion and multistage maturation of specialized ER exit domains<\/i> (2003)
\nBen-Tekaya H, Miura K, Pepperkok R, Hauri HP Live imaging of bidirectional traffic from the ERGIC<\/i> (2005)
\nLord C, Ferro-Novick S, Miller EA The Highly Conserved COPII Coat Complex Sorts Cargo from the Endoplasmic Reticulum and Targets It to the Golgi<\/i> (2013)<\/span><\/p>\n

Le Golgi est un organite complexe. L\u2019approche morphologique \u00ab statique \u00bb, en deux dimensions, a apport\u00e9 son lot d\u2019information sur son architecture : les donn\u00e9es obtenues par l\u2019examen de coupes ultra fines (70\u2013100 nm) au microscope \u00e9lectronique \u00e0 transmission sont \u00e0 la base de nos connaissances : un empilement de saccules entour\u00e9 de tubules, de v\u00e9sicules et de structures membranaires polymorphes. Pour d\u00e9couvrir d\u2019\u00e9ventuelles connexions entre saccules ou entre dictyosomes, il fallait acc\u00e9der \u00e0 des repr\u00e9sentations tridimensionnelles. La premi\u00e8re approche exp\u00e9rimentale utilis\u00e9e, l\u2019examen au microscope \u00e9lectronique de coupes en s\u00e9ries a \u00e9t\u00e9 supplant\u00e9 par la tomographie \u00e9lectronique \u00e0 haut voltage (High-voltage dual axis 3D electron tomography<\/i>) sur coupes \u00e9paisses (3 \u00e0 4 \u00b5m).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Rambourg A, Clermont Y, Marraud A Three-dimensional structure of the osmium-impregnated Golgi apparatus as seen in the high voltage electron microscope<\/i> (1974)
\nRambourg A, Clermont Y, Marraud A Three-dimensional structure of the osmium-impregnated Golgi apparatus as seen in the high voltage electron microscope<\/i> (1974)
\nRambourg A, Clermont Y, Hermo L Three-dimensional architecture of the golgi apparatus in Sertoli cells of the rat<\/i> (1979)
\nRambourg A, Segretain D, Clermont Y Tridimensional architecture of the Golgi apparatus in the atrial muscle cell of the rat<\/i> (1984)
\nDylewski DP, Haralick RM, Keenan TW Three-dimensional ultrastructure of the Golgi apparatus in bovine mammary epithelial cells during lactation<\/i> (1984)
\nRambourg A, Clermont Y Tridimensional structure of the Golgi apparatus in type A ganglion cells of the rat<\/i> (1986)
\nRambourg A, Clermont Y Three-dimensional electron microscopy: structure of the Golgi apparatus<\/i> (1990)
\nLadinsky MS, Mastronarde DN, McIntosh JR, Howell KE, Staehelin LA Golgi structure in three dimensions: functional insights from the normal rat kidney cell<\/i> (1999)<\/span><\/p>\n

La microscopie corr\u00e9lative CLEM (Correlative Light and Electron Microscopy<\/i>) permet de combiner les images obtenues, \u00e0 partir d\u2019un m\u00eame \u00e9chantillon, par microscopie \u00e0 fluorescence sur des cellules vivantes et en temps r\u00e9el, et par microscopie \u00e9lectronique. La pr\u00e9paration de l\u2019\u00e9chantillon \u00e0 observer (fixation, enrobage, coupe) est faite \u00e0 temp\u00e9rature cryog\u00e9nique. La prot\u00e9ine verte fluorescente (GFP), ou une chim\u00e8re prot\u00e9ine-GFP, peut \u00eatre d\u00e9tect\u00e9e et cibl\u00e9e par microscopie confocale \u00e0 balayage laser (Confocal Laser Scanning Microscopy<\/i>) avant d\u2019\u00eatre observ\u00e9e au microscope \u00e9lectronique ; celle-ci fournit les donn\u00e9es ultra-structurales qui font d\u00e9faut avec la microscopie \u00e0 fluorescence et cette derni\u00e8re fournit des information sur le m\u00e9canisme et la dynamique d\u2019un processus cellulaire, comme la voie s\u00e9cr\u00e9toire, qui sont inaccessibles par microscopie \u00e9lectronique. La microscopie corr\u00e9lative CLEM permet d\u2019\u00e9tudier un \u00e9chantillon avec une r\u00e9solution inf\u00e9rieure au nanom\u00e8tre.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Noske AB, Costin AJ, Morgan GP, Marsh BJ Expedited approaches to whole cell electron tomography and organelle mark-up in situ in high-pressure frozen pancreatic islets<\/i> (2008)<\/span><\/p>\n

Avec les travaux de Robert Eric Betzig (Molecular and Cell Biology Department, The University of California, Berkeley<\/i>), l\u2019imagerie microscopique a franchi une \u00e9tape suppl\u00e9mentaire. La Near Field Scanning Optical Microscopy<\/i> (NSOM<\/i>) permet d\u2019atteindre une r\u00e9solution proche de celle obtenue avec un microscope \u00e9lectronique \u00e0 balayage (500\u00c5), \u00e0 partir d\u2019une radiation visible utilisable en milieu aqueux, ce qui rend accessible l\u2019observation de cellules in vivo ou le transport intracellulaire \u00e0 l\u2019\u00e9chelle mol\u00e9culaire. Je renvoie au m\u00e9moire pr\u00e9sent\u00e9 par Betzig en 1988, le lecteur d\u00e9sireux de savoir comment il a r\u00e9ussi \u00e0 produire des images \u00e0 tr\u00e8s haute r\u00e9solution (inf\u00e9rieure au nanom\u00e8tre) en franchissant la limite de diffraction des techniques conventionnelles de microscopie optique. Betzig a re\u00e7u le Prix Nobel de Chimie 2014 pour ses travaux sur la microscopie \u00e0 fluorescence \u00e0 super-r\u00e9solution et la nano-microscopie.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Betzig E, Lewis A, Harootunian A, Isaacson M, Kratschmer E Near Field Scanning Optical Microscopy (NSOM): Development and Biophysical Applications<\/i> (1986)
\nBetzig RE Non-destructive optical imaging of surfaces with 500 \u00e5ngstrom resolution<\/i> (1988)
\nBetzig E, Trautman JK Near-Field Optics : Microscopy, Spectroscopy, and Surface Modification Beyond the Diffraction Limit<\/i> (1992)
\nGao L, Shao L, Higgins CD, Wu X, Goldstein B, Betzig E Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens<\/i> (2012)<\/span><\/p>\n

Pour suivre le d\u00e9placement d\u2019un cargo, la premi\u00e8re technique utilis\u00e9e fut l\u2019immuno-microscopie \u00e9lectronique \u00e0 l\u2019aide d\u2019anticorps. Le fait que le Golgi soit travers\u00e9 par un flux continu de prot\u00e9ines et de lipides n\u00e9cessitait de recourir \u00e0 une approche morphologique \u00ab dynamique \u00bb et donc d\u2019observer le d\u00e9placement du cargo in vivo et en temps r\u00e9el. C\u2019est devenu possible avec l\u2019utilisation de la microscopie \u00e0 super-r\u00e9solution, des prot\u00e9ines fluorescentes (Green Fluorescent Protein<\/i>, GFP) et des prot\u00e9ines fluorescentes phototransformables. La fluorescence des mol\u00e9cules n\u2019est pas permanente ; son intensit\u00e9 diminue avec le temps et devient ind\u00e9tectable. On peut alt\u00e9rer et m\u00eame \u00e9teindre la fluorescence, par exemple en irradiant le fluorophore avec un laser. Le photoblanchiment est \u00e0 la base d\u2019une technique dans laquelle on supprime la fluorescence d\u2019une zone \u00e0 laquelle on s\u2019int\u00e9resse sans affecter la fluorescence des autres r\u00e9gions de l\u2019organite ou de la cellule. C\u2019est ainsi que l\u2019on peut observer la dynamique d\u2019un processus en temps r\u00e9el \u00e0 l\u2019\u00e9chelle nanom\u00e9trique. Il en va de m\u00eame avec les fluorophores photoactivables : on peut illuminer enfluorescence une zone particuli\u00e8re \u00e0 un moment pr\u00e9cis. Eric Betzig, Harald Hess et Jennifer Lippincott-Schwartz ont baptis\u00e9 \u00ab localisation microscopique par photoactivation (PhotoActivated Localization Microscopy, PALM<\/i>) la technique microscopique sur coupes fines qui leur a permis d\u2019obtenir des images de prot\u00e9ines intracellulaires \u00e0 une r\u00e9solution spatiale de l\u2019ordre du nanom\u00e8tre. Les prot\u00e9ines fluorescentes photoactivables ont \u00e9t\u00e9 successivement illumin\u00e9es puis blanchies. Une fois rassembl\u00e9es, les diff\u00e9rentes images obtenues fournissent une image \u00e0 super-r\u00e9solution. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Betzig E, Patterson GH, Sougrat R, Lindwasser OW, Olenych S, Bonifacino JS, Davidson MW, Lippincott-Schwartz J, Hess HF Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution<\/i> (2006)
\nTakeuchi M, Ozawa T Methods for imaging and analyses of intracellular organelles using fluorescent and luminescent proteins<\/i> (2007)
\nLippincott-Schwartz J, Manley S Putting super-resolution fluorescence microscopy to work<\/i> (2009)<\/span><\/p>\n

Note: Yang Zhang et coll. (Department of Textile Engineering, Chemistry and Science, North Carolina State University, Raleigh<\/i>) ont cr\u00e9\u00e9 des fluorophores photoactivatables pouvant passer de l\u2019\u00e9tat \u201c\u00e9metteur de fluorescence\u201d \u00e0 l\u2019 l\u2019\u00e9tat \u201cnon \u00e9metteur\u201d fluorophores.<\/span><\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Yang Zhang Y, Zheng Y, Tomassini A, Singh AK, Raymo FM Photoactivatable Fluorophores for Bioimaging Applications<\/i> (2023)<\/span><\/p>\n

Jennifer Lippincott-Schwartz et coll. (Section on Organelle Biology, Cell Biology and Metabolism Branch, NIH, Bethesda<\/i>) ont suivi le d\u00e9placement d\u2019une chim\u00e8re de la glycoprot\u00e9ine-G membranaire avec la prot\u00e9ine verte fluorescente (VSVG-GFP). Apr\u00e8s avoir quitt\u00e9 le reticulum endoplasmique, les v\u00e9sicules s\u2019assemblent en structures pr\u00e9-golgiennes (VTC) de morphologies variables ; le d\u00e9placement des v\u00e9sicules du Golgi vers la membrane plasmique est guid\u00e9 par les microtubules. Une \u00e9tude similaire a \u00e9t\u00e9 effectu\u00e9e par Nelson B. Cole et coll. avec des glycosyl transf\u00e9rases.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Cole NB, Smith CL, Sciaky N, Terasaki M, Edidin M, Lippincott-Schwartz J Diffusional Mobility of Golgi Proteins in Membranes of Living Cells<\/i> (1996)
\nPresley JF, Cole NB Schroer TA, Hirschberg K, Zaal KJ, Lippincott-Schwartz J ER-to-Golgi transport visualized in living cells<\/i> (1997)
\nHirschberg K, Miller CM, Ellenberg J, Presley JF, Siggia ED, Phair RD, Lippincott-Schwartz J Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells<\/i> (1998)<\/span><\/p>\n

<\/a>Exocytose, endocytose<\/b><\/span><\/h3>\n

Pour rester dans le cadre de ce chapitre, je d\u00e9finirai l\u2019exocytose comme le m\u00e9canisme d\u2019exportation des prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires entre le r\u00e9seau trans-golgien et la membrane plasmique. Plus g\u00e9n\u00e9ralement, c\u2019est le m\u00e9canisme par lequel la cellule exporte dans le milieu extracellulaire des mol\u00e9cules (hormones, neurotransmetteurs) ou des complexes mol\u00e9culaires volumineux. Le transport s\u2019effectue par v\u00e9sicules, issues du trans-Golgi et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Il existe une exocytose constitutive, pr\u00e9sente chez toutes les cellules eucaryotes ; il existe aussi une exocytose r\u00e9gul\u00e9e par les ions Ca2+<\/sup>, par exemple chez les cellules du syst\u00e8me nerveux. <\/p>\n

La richesse en v\u00e9sicules du cytoplasme des cellules eucaryotes a \u00e9t\u00e9 r\u00e9v\u00e9l\u00e9e par l\u2019examen de coupes fines au microscope \u00e9lectronique \u00e0 transmission. Diverses tentatives ont \u00e9t\u00e9 effectu\u00e9es pour les isoler par fractionnement subcellulaire. Les cellules des tissus nerveux et placentaires sont particuli\u00e8rement riches en v\u00e9sicules. Les cellules du syst\u00e8me nerveux central synth\u00e9tisent des neurom\u00e9diateurs, les stockent dans des v\u00e9sicules qui se d\u00e9placent le long des axones jusqu\u2019au bouton synaptique et fusionnent avec la membrane de la synapse, lib\u00e9rant ainsi les neurom\u00e9diateurs dans l\u2019espace interneuronal. Le placenta est compos\u00e9 de diff\u00e9rents types de cellules parmi lesquelles les trophoblastes, qui sont le site d\u2019\u00e9changes m\u00e9taboliques entre le sang maternel et le f\u0153tus. Les premi\u00e8res tentatives de fractionnement subcellulaire entreprises pour isoler les v\u00e9sicules n\u2019ont pas \u00e9t\u00e9 couronn\u00e9es de succ\u00e8s, en partie \u00e0 cause de la pr\u00e9sence de saccharose dans les milieux d\u2019homog\u00e9n\u00e9isation et de fractionnement ; cette mol\u00e9cule polaire alt\u00e8re les v\u00e9sicules. <\/p>\n

Barbara Pearse (Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology, Cambridge<\/i>) a utilis\u00e9 un milieu isotonique sans saccharose pour isoler, par centrifugation en gradient de densit\u00e9, les v\u00e9sicules de cerveau de porc ; par la suite, elle utilisa un gradient de Ficoll, un copolym\u00e8re de saccharose et d\u2019\u00e9pichlorhydrine, dissous dans l\u2019eau lourde 2<\/sup>H2O. L\u2019analyse, par \u00e9lectrophor\u00e8se en gel de polyacrylamide en pr\u00e9sence de SDS, de la composition en prot\u00e9ines des v\u00e9sicules isol\u00e9es r\u00e9v\u00e9la la pr\u00e9sence de polypeptides de poids mol\u00e9culaires apparents de 36 \u00e0 180 kDa. Les v\u00e9sicules \u00ab tapiss\u00e9es \u00bb isol\u00e9es \u00e0 partir d\u2019une vari\u00e9t\u00e9 de tissus sont toutes constitu\u00e9es d\u2019une membrane phospholipidique, entour\u00e9e d\u2019une couche de \u00ab complexes adaptateurs prot\u00e9iques \u00bb (340 kDa, 4 sous-unit\u00e9s polypeptidiques). Cette couche est entour\u00e9e d\u2019une \u00ab cage \u00bb de clathrine. La pr\u00e9sence de ces deux couches, et la mani\u00e8re dont elles imbriqu\u00e9es l\u2019une dans l\u2019autre, sont visibles dans la repr\u00e9sentation tri-dimensionnelle obtenue par Thomas Walz et coll. (Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston<\/i>) par cryo-microscopie \u00e9lectronique \u00e0 l\u2019\u00e9chelle sub-nanom\u00e9trique,. La vari\u00e9t\u00e9 de poids mol\u00e9culaires des polypeptides s\u00e9par\u00e9s par \u00e9lectrophor\u00e8se s\u2019explique par le fait que les modes d\u2019extraction utilis\u00e9s lib\u00e9raient des peptides issus des deux couches. Il est possible d\u2019extraire le squelette de clathrine – \u00ab triskelion \u00bb – en traitant les v\u00e9sicules par du cholate. La clathrine est constitu\u00e9e de trois cha\u00eenes lourdes (de 180 kDa) et de trois cha\u00eenes l\u00e9g\u00e8res (36 \u00e0 40 kDa). Sa fonction serait essentiellement structurale. La taille des v\u00e9sicules \u00e0 clathrine est en moyenne de 80 nm. Dans les ovocytes de poulet coexistent des v\u00e9sicules de 80 \u00e0 150 nm renfermant un contenu prot\u00e9ique, et des v\u00e9sicules de 50 \u00e0 80 nm qui semblent vides. Il pourrait exister une navette incluant des grosses v\u00e9sicules transportant le cargo du trans-Golgi vers la membrane plasmique et l\u2019ext\u00e9rieur de la cellules, et de petites v\u00e9sicules vides retournant vers le trans-Golgi. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Pearse BMF Coated vesicles from pig brain: Purification and biochemical characterization<\/i> (1975)
\nPearse BMF On the structural and functional components of coated vesicles<\/i> (1978)
\nWoods JW, Woodward MP, Roth TF Common features of coated vesicles from dissimilar tissues: composition and structure<\/i> (1978)
\nPearse BMF Coated vesicles from human placenta carry ferritin, transferrin, and immunoglobulin G<\/i> (1982)
\nFotin A, Cheng Y, Sliz P, Grigorieff N, Harrison SC, Kirchhausen T, Walz T Molecular model for a complete lattice from electron cryomicroscopy<\/i> (2004)<\/span><\/p>\n

Certaines mol\u00e9cules hydrophobes (hormones st\u00e9ro\u00efdes) peuvent franchir la bicouche phospholipidique de la membrane plasmique ; il en va de m\u00eame pour les mol\u00e9cules de petite taille, non-charg\u00e9es (ur\u00e9e, glyc\u00e9rol, eau). Pour les mol\u00e9cules polaires, comme les sucres (groupes hydroxyle), et les atomes et mol\u00e9cules charg\u00e9s (Ca2+<\/sup>, Na+<\/sup>, K+<\/sup>, HCO3<\/sub>–<\/sup>, Cl–<\/sup>), le franchissement de la membrane plasmique se fait via des canaux ou des transporteurs. Les complexes volumineux ont recours \u00e0 l\u2019endocytose, le m\u00e9canisme par lequel les cellules de mammif\u00e8res ou les \u00eatres unicellulaires int\u00e9riorisent les mol\u00e9cules nutritives et les hormones n\u00e9cessaires \u00e0 leur d\u00e9veloppement. La phagocytose est la capture par les cellules de particules solides dans le milieu environnant. Le terme \u00ab phagocytose \u00bb d\u00e9signait \u00e0 l\u2019origine le processus de destruction des bact\u00e9ries par les phagocytes (une cat\u00e9gorie de leucocytes), d\u00e9couvert en 1882 par Ilya Ilitch (Elie) Metchnikov (prix Nobel de m\u00e9decine ou physiologie 1908). La pinocytose est le processus non sp\u00e9cifique d\u2019internalisation de micromol\u00e9cules et de liquide extracellulaire dans des v\u00e9sicules de petite taille, dont le contenu est d\u00e9vers\u00e9 dans les lysosomes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Metchnikov E Le\u00e7ons sur la pathologie compar\u00e9e de l\u2019inflammation (1891) <\/span><\/p>\n

Dans pratiquement toutes les cellules eucaryotes, l\u2019endocytose d\u00e9bute par une invagination localis\u00e9e de la membrane plasmique, qui devient un puit tapiss\u00e9 (coated pit<\/i>), puis une v\u00e9sicule tapiss\u00e9e \u00e0 clathrine. Ces v\u00e9sicules se d\u00e9tachent de la membrane plasmique et fusionnent entre elles dans le cytosol pour former des endosomes pr\u00e9coces dont le contenu est voisin de la neutralit\u00e9 (pH 7,4). Il s\u2019acidifie progressivement par le jeu de pompes \u00e0 protons transport\u00e9es par v\u00e9sicules depuis le complexe de Golgi et ins\u00e9r\u00e9es dans la membrane endosomale. Les prot\u00e9ines et les petites mol\u00e9cules internalis\u00e9es par endocytose sont tri\u00e9es dans les endosomes et dirig\u00e9es vers diverses destinations, dont les lysosomes.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Lawrence M, Ray S, Babyonyshev M, Galluser R, Borhani DW, Harrison SC, Crystal Structure of the Ectodomain of Human Transferrin Receptor<\/i> (1999)
\nSteere AN, Byrne SL, Chasteen ND, Mason AB Kinetic of iron release from transferrin bound to the transferrin receptor at endosomal pH<\/i> (2012)
\nCheng Y, Zak O, Aisen P, Harrison SC, Walz T Structure of the human transferrin receptor-transferrin complex<\/i> (2004)<\/span><\/p>\n

Prenons deux exemples d\u2019internalisation par endocytose ; le cholest\u00e9rol joue de multiples r\u00f4les dans les cellules : il entre dans la composition des membranes phospholipidiques, comme la membrane plasmique ; il entre dans la voie biosynth\u00e9tique des \u0153strog\u00e8nes, de la testost\u00e9rone, des acides biliaires, de la vitamine D. Le cholest\u00e9rol provient en partie de l\u2019alimentation et en partie de la biosynth\u00e8se h\u00e9patique. Pour \u00eatre distribu\u00e9 aux cellules, ce st\u00e9rol circule dans le sang associ\u00e9 \u00e0 des complexes lipoprot\u00e9iques. Les lipoprot\u00e9ines de basse densit\u00e9 sont de volumineux ensembles form\u00e9s d\u2019une partie prot\u00e9ique, l\u2019apolipoprot\u00e9ine, de phospholipides, de triglyc\u00e9rides, de vitamines et de cholest\u00e9rol. En 1974, Michael Brown et Joseph Goldstein (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas<\/i>) d\u00e9couvrirent que l\u2019entr\u00e9e des LDL (Low Density Lipoproteins<\/i>) dans les fibroblastes n\u00e9cessite la pr\u00e9sence d\u2019un composant de la membrane plasmique. Cette observation conduisit \u00e0 la d\u00e9couverte du r\u00e9cepteur membranaire des LDL et du r\u00f4le jou\u00e9 par les LDL dans la biosynth\u00e8se du cholest\u00e9rol : elles v\u00e9hiculent le cholest\u00e9rol dans le plasma sanguin et p\u00e9n\u00e8trent dans les h\u00e9patocytes, en se fixant sur le r\u00e9cepteur des LDL, et lib\u00e8rent le cholest\u00e9rol dans la cellule. Goldstein et Brown re\u00e7urent le prix Nobel de physiologie ou m\u00e9decine en 1985.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rence : Brown MS, Goldstein JL Familial hypercholesterolemia: Defective binding of lipoproteins to cultured fibroblasts associated with impaired regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity<\/i> (1974)<\/span><\/p>\n

Le cation fer (Fe3+<\/sup>\/Fe2+<\/sup>), li\u00e9 \u00e0 quatre atomes d\u2019azote d\u2019une porphyrine, est le groupe prosth\u00e9tique de l\u2019h\u00e9moglobine ; ce pigment respiratoire, pr\u00e9sent dans le sang des vert\u00e9br\u00e9s, transporte l\u2019oxyg\u00e8ne des poumons vers les cellules. Le fer, absorb\u00e9 par le tube digestif est transport\u00e9 de l\u2019intestin vers les cellules li\u00e9 \u00e0 une \u03b2-globuline de 77 kDa ; en effet, le fer ferrique (Fe3+<\/sup>) est insoluble dans le plasma sanguin et le fer ferreux (Fe2+<\/sup>) est toxique. La transferrine remplit \u00e0 la fois un r\u00f4le de stockage et de transport ; elle est capt\u00e9e, par des r\u00e9cepteurs (Transferrin Receptor<\/i> TfR1, TfR2) de la membrane plasmique. La transferrine, avec les deux atomes de fer Fe3+<\/sup> qu\u2019elle transporte, et son r\u00e9cepteur sont internalis\u00e9s par endocytose dans des v\u00e9sicules \u00e0 clathrine. La structure cristallographique du r\u00e9cepteur et de son ligand a \u00e9t\u00e9 \u00e9tablie du fait de leur implication en pathologie. Le complexe est int\u00e9rioris\u00e9 par endocytose dans des v\u00e9sicules \u00e0 clathrine form\u00e9es par invagination de la membrane plasmique. Apr\u00e8s passage dans les endosomes, l\u2019acidification progressive du pH (pH initial 6,5) lib\u00e8re le fer (Fe3+<\/sup>) de l\u2019apo-transferrine ; le r\u00e9cepteur est renvoy\u00e9 \u00e0 la membrane plasmique.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : C. Martin Lawrence, Ray S, Babyonyshev M, Galluser R, Borhani DW, Harrison SC Crystal Structure of the Ectodomain of Human Transferrin Receptor<\/i> (1999)
\nCheng Y, Zak O, Aisen P, Harrison SC, Walz T Structure of the human transferrin receptor-transferrin complex<\/i> (2004)<\/span><\/p>\n

<\/a>Le trans-Golgi est un centre de tri des prot\u00e9ines<\/b><\/span><\/h3>\n

Le cis-Golgi est la porte d\u2019entr\u00e9e de la voie s\u00e9cr\u00e9toire ; le r\u00e9seau trans-golgien (Trans-Golgi Network, TGN<\/i>) en est la porte de sortie. C\u2019est le point d\u2019aboutissement des v\u00e9sicules COPII qui ont travers\u00e9 le complexe de Golgi. On conna\u00eet sa structure microscopique : un groupe de chercheurs autour de Lucas A. Staehelin (University of Colorado, Boulder<\/i>) a r\u00e9alis\u00e9, par cryo-tomographie \u00e9lectronique \u00e0 haut voltage,une reconstruction tri-dimensionnelle du trans-Golgi de cellule de rein de rat \u00e0 une r\u00e9solution de \u223c7-nm.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Clermont Y, Rambourg A, Hermo L Trans-Golgi network (TGN) of different cell types: three-dimensional structural characteristics and variability<\/i> (1995)
\nLadinsky MS, Mastronarde DN, McIntosh JR, Howell KE, Staehelin LA Golgi structure in three dimensions: functional insights from the normal rat kidney cell<\/i> (1999)<\/span><\/p>\n

On a identifi\u00e9 un certain nombre de prot\u00e9ines caract\u00e9ristiques : (i) TGN51 (Trans-Golgi Network protein of 51 kDa<\/i>), dans le placenta humain ; (ii) TGN38\/41 (Trans-Golgi Network protein of 38\/41 kDa<\/i>), dont les deux isoformes (TGN38 et TGN41) ont \u00e9t\u00e9 caract\u00e9ris\u00e9es chez le rat et la souris par Paul Luzio et coll. (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg<\/i>). Les prot\u00e9ines TGN poss\u00e8dent dans leur s\u00e9quence des motifs qui dirigent leur localisation dans le trans-Golgi (Ser23<\/sub>-Tyr25<\/sub>-Leu28<\/sub>) ou leur recyclage entre la membrane plasmique et le trans-Golgi (motif \u00e0 tyrosine Tyr-Gln-Arg-Leu). La glycoprot\u00e9ine transmembranaire TGN38\/4 intervient dans la formation des v\u00e9sicules d\u2019exocytose. Nous verrons plus loin que le trans-Golgi renferme aussi les r\u00e9cepteurs du mannose-6-phosphate. La fonction principale du trans-Golgi est d\u2019effectuer le tri du cargo dans des v\u00e9sicules de transport, qui sont sp\u00e9cifiques de trois destinations : (i) granules de s\u00e9cr\u00e9tion (destination par d\u00e9faut des prot\u00e9ines s\u00e9cr\u00e9toires : s\u00e9rum albumine, collag\u00e8ne\u2026) ; (ii) membrane plasmique (glycoprot\u00e9ines transmembranaires, r\u00e9cepteurs) ; (iii) endosome ou lysosomes. Il existe aussi, \u00e0 partir du r\u00e9seau trans-golgien, un transport r\u00e9trograde par des v\u00e9sicules COPI de glycosyl-transf\u00e9rases vers la citerne trans du dichtyosome. Les citernes cis, m\u00e9diane et trans du Golgi produisent par bourgeonnement des v\u00e9sicules COPI et COPII ; seule une citerne du r\u00e9seau trans-golgien produit des v\u00e9sicules \u00e0 clathrine. <\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Luzio JP, Brake B, Banting G, Howell KE, Braghetta P, Stanley KK Identification, sequencing and expression of an integral membrane protein of the trans-Golgi network (TGN38) <\/i> (1990)
\nReaves B, Horn M, Banting G TGN38\/41 recycles between the cell surface and the TGN: brefeldin A affects its rate of return to the TGN<\/i> (1993)
\nWong SH, Hong W The SXYQRL sequence in the cytoplasmic domain of TGN38 plays a major role in trans-Golgi network localization<\/i> (1993)
\nReaves B, Horn M, Banting G TGN38\/41 recycles between the cell surface and the TGN: brefeldin A affects its rate of return to the TGN<\/i> (1993)
\nPonnambalam S, Rabouille C, Luzio JP, Nilsson T, Warren G The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network <\/i> (1994)
\nKain R, Angata K, Kerjaschki D, Fukuda M Molecular cloning and expression of a novel human trans-Golgi network glycoprotein, TGN51, that contains multiple tyrosine-containing motifs<\/i> (1998)<\/span><\/p>\n

Les travaux du groupe de James Rothman ont abouti \u00e0 la conclusion qu\u2019au sein des cellules le transport par v\u00e9sicules est organis\u00e9 selon un sch\u00e9ma g\u00e9n\u00e9ral, avec des variations en fonction les compartiments ; en ce qui concerne le trans-Golgi, les v\u00e9sicules qui en sont issues transportent un cargo diff\u00e9rent selon leur destination. Deux questions se posent : (i) Comment se fait la s\u00e9lection du cargo en fonction des destinations ? (ii) Quel est le m\u00e9canisme qui permet \u00e0 une v\u00e9sicule de reconna\u00eetre sa membrane cible et de fusionner avec elle ? Le tri du cargo est op\u00e9r\u00e9 par des complexes h\u00e9t\u00e9ro-t\u00e9tram\u00e9riques de prot\u00e9ines adaptatrices (AP1, AP2, AP3) situ\u00e9es dans l\u2019enveloppe des v\u00e9sicules. Les r\u00e9sultats des \u00e9tudes men\u00e9es sur les cellules actives dans l\u2019exocytose r\u00e9gul\u00e9e de neurotransmetteurs (neurones) ou d\u2019hormones (cellules endocrines) ont apport\u00e9 une r\u00e9ponse \u00e0 la seconde question. Jean-Pierre Henry (Universit\u00e9 Diderot, Paris) a \u00e9num\u00e9r\u00e9 les m\u00e9thodes physiques utilis\u00e9es au cours de ces \u00e9tudes, en particulier la microscopie en fluorescence excit\u00e9e par onde \u00e9vanescente qui permet d\u2019observer \u00e0 l\u2019\u00e9chelle nanom\u00e9trique des ph\u00e9nom\u00e8nes se produisant \u00e0 la surface des membranes. En ce qui concerne la fusion entre la membrane de la v\u00e9sicule et la membrane cible, j\u2019ai mentionn\u00e9 dans le sous-chapitre \u00ab Trafic v\u00e9siculaire \u00bb, le r\u00f4le des r\u00e9cepteurs de la superfamille des SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein REceptor<\/i>) – une soixantaine de membres chez les mammif\u00e8res : v-Snare dans la membrane des v\u00e9sicules, t-SNARE dans la membrane cible. L\u2019interaction entre v-SNARE et t-SNARE commence d\u00e8s que les deux membranes entrent en contact (docking<\/i> et tethering<\/i>).<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Rothman JE, Wieland FT Protein sorting by transport vesicles<\/i> (1996)
\nHenry JP, Darchen F, Cribier S Physical techniques for the study of exocytosis in isolated cells<\/i> (1998)<\/span><\/p>\n

En 1883, le physiologiste Rudolf Heidenhain d\u00e9crivit la pr\u00e9sence de volumineux granules au sein des cellules pancr\u00e9atiques. Hershey Warshawsky et coll. (Department of Anatomy, McGill University, Montreal<\/i>) et George Palade et James Jamieson (Rockefeller Institute for Medical Research<\/i>) ont montr\u00e9 que lorsqu\u2019on injecte \u00e0 un animal des acides amin\u00e9s radioactifs, la radioactivit\u00e9 se retrouve in fine<\/i> dans les grains de s\u00e9cr\u00e9tion qui occupent l\u2019espace situ\u00e9 entre le trans-Golgi et la membrane plasmique ; ils stockent le cargo avant son exportation \u00e0 l\u2019ext\u00e9rieur de la cellule. Dans le pancr\u00e9as exocrine, les enzymes digestifs (zymog\u00e8nes) sont tri\u00e9s, empaquet\u00e9s et compact\u00e9s dans les granules de s\u00e9cr\u00e9tion qui se forment par \u00e9vagination de la membrane du trans-Golgi, subissent un processus de maturation, se d\u00e9tachent du r\u00e9seau trans-golgien et fusionnent avec la membrane plasmique. Le cargo est export\u00e9 dans des canaux conduisant \u00e0 l\u2019intestin. On distingue une \u00ab s\u00e9cr\u00e9tion constitutive \u00bb et une \u00ab s\u00e9cr\u00e9tion r\u00e9gul\u00e9e \u00bb ; la premi\u00e8re est pr\u00e9sente chez toutes les cellules eucaryotes, par exemple, la s\u00e9cr\u00e9tion dans l\u2019espace lacunaire d\u2019hydrolases acides par les ost\u00e9oclastes, des cellules sp\u00e9cialis\u00e9es dans la r\u00e9sorption du tissu osseux ; la seconde est pr\u00e9sente dans les glandes digestives et les glandes exocrines, o\u00f9 l\u2019exocytose est d\u00e9clench\u00e9e par un stimulus ou des signaux hormonaux ; dans les cellules \u03b2 du pancr\u00e9as, une \u00e9l\u00e9vation du taux sanguin de glucose stimule le d\u00e9clenchement de l\u2019exocytose de l\u2019insuline contenue dans les v\u00e9sicules. Les glycoprot\u00e9ines dont la destination finale est la membrane plasmique, voyagent dans la membrane des v\u00e9sicules transportant le cargo soluble. Kai Simons et coll. ont mis en \u00e9vidence l\u2019implication du cytosquelette dans l\u2019exocytose entre le trans-Golgi et la membrane plasmique en suivant, en microscopie confocale et vid\u00e9o-microscopie, le parcours de la prot\u00e9ine de fusion VSVG-GFP.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Warshawsky H, Leblond CP, Droz B Synthesis and migration of proteins in the cells of the exocrine pancreas as revealed by specific activity determination from radioautographs<\/i> (1963)
\nJamieson JD, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell. I. Role of the peripheral elements of the Golgi complex<\/i> (1967)
\nJamieson JG, Palade GE Intracellular transport of secretory proteins in the pancreatic exocrine cell. II. Transport to Condensing Vacuoles and Zymogen Granules<\/i> (1967)
\nSalamero J, Sztul ES, Howell KE Exocytic transport vesicles generated in vitro from the trans-Golgi network carry secretory and plasma membrane proteins<\/i> (1990)
\nKeller P, Toomre D, White J, Simons K. Dual color visualization of trans-Golgi network to plasma membrane trafficking using GFP-fusion proteins<\/i> (1998)
\nToomre D, Keller P, White J, Olivo J -C, Simons K. Dual-color visualization of trans-Golgi network to plasma membrane traffic along microtubules in living cells<\/i> (1999)<\/span><\/p>\n

Comme toutes les prot\u00e9ines synth\u00e9tis\u00e9es par les polysomes li\u00e9s \u00e0 la membrane du reticulum endoplasmique, les glycoprot\u00e9ines lysosomiales sont dot\u00e9es d\u2019une \u00ab s\u00e9quence topog\u00e9nique \u00bb sous forme d\u2019un peptide signal amino-terminal. Les travaux d\u2019Elizabeth F. Neufeld (National Institute of Arthritis, Metabolism, and Digestive Diseases<\/i>) sur la mucolipidose de type II ont conduit \u00e0 l\u2019identificationd\u2019une seconde s\u00e9quence topog\u00e9nique sous forme d\u2019un sucre phosphoryl\u00e9, dirigeant ces glycoprot\u00e9ines vers les lysosomes. La mucolipidose de type II (I-cell disease<\/i>), ou maladie des cellules d\u2019inclusion, est une maladie h\u00e9r\u00e9ditaire \u00e0 transmission autosomale r\u00e9cessive ; elle est caus\u00e9e par des mutations dans le g\u00e8ne codant pour les sous-unit\u00e9s \u03b1 et \u03b2 de la N-ac\u00e9tylglucosamine-phosphotransf\u00e9rase, un enzyme du cis Golgi. William S. Sly (St. Louis University School of Medicine<\/i>) montra qu\u2019une \u00ab forme acide \u00bb de la \u03b2-glucuronidase, une hydrolases lysosomale, est pinocyt\u00e9e plus activement par les fibroblastes dans le milieu de culture qu\u2019une forme moins acide. La forme acide contenait un phosphate \u00e0 proximit\u00e9 d\u2019un r\u00e9sidu mannose. Apr\u00e8s les observations de Neufeld , le r\u00e9sultat de Sly ouvrit la voie \u00e0 l\u2019\u00e9lucidation de la voie m\u00e9tabolique du mannose 6-P, principalement, par les groupes de Stuart Kornfeld (Washington University School of Medicine, St. Louis<\/i>) et de Kurt von Figura (Georg August Universit\u00e4t, G\u00f6ttingen<\/i>). Ira Tabas et Stuart Kornfeld isol\u00e8rent, partir de cellules marqu\u00e9es au 3<\/sup>H, un enzyme portant un Man-6-P ; ce r\u00e9sidu \u00e9tait insensible \u00e0 un traitement par une phosphatase : le sucre phosphoryl\u00e9 \u00e9tait masqu\u00e9 par une N-ac\u00e9tylglucosamine. La synth\u00e8se de la s\u00e9quence topog\u00e9nique des glycoprot\u00e9ines lysosomiales – un r\u00e9sidu Man-6-P en position terminale de la cha\u00eene oligosaccharidique \u2013 est un processus en deux \u00e9tapes : (i) dans le cis-Golgi, une N-ac\u00e9tylglucosamine-phosphotransf\u00e9rase, apr\u00e8s reconnaissance de certaines s\u00e9quences de la partie peptique des glycoprot\u00e9ines lysosomiales, transfert un GlcNAc-P \u00e0 partir d\u2019UDP-GlcNAc \u00e0 un ou plusieurs r\u00e9sidus Man ; (ii) l\u2019\u00e9tape cruciale est catalys\u00e9e par une phosphodiest\u00e9rase (Mannose-6-Phosphate Uncovering Enzyme<\/i>) du trans-Golgi, qui retire le groupe GlcNAc, d\u00e9masquant ainsi le Man-6-P. Chez les patients atteints de mucolipidose de type II, l\u2019absence de synth\u00e8se du signal de localisation, entra\u00eene l\u2019exportation dans le plasma sanguin des hydrolases acides destin\u00e9es aux lysosomes. \u00c9tant donn\u00e9 l\u2019implication en pathologie de la d\u00e9ficience en phosphodiest\u00e9rase, la structure cristallographique du Mannose-6-Phosphate Uncovering Enzyme<\/i> a \u00e9t\u00e9 \u00e9lucid\u00e9e par Alexei Gorelik et coll. (Department of Biochemistry, McGill University, Montreal<\/i>). Le trans-Golgi renferme deux r\u00e9cepteurs membranaires du Man-6-P (Cation dependent Mannose-6-Phosphate Receptor, et Cation independent Mannose-6-Phosphate Receptor<\/i>). Les hydrolases acides et les enzymes de la membrane lysosomiale li\u00e9s au r\u00e9cepteur sont d\u00e9livr\u00e9s \u00e0 leur destination par des navettes de v\u00e9sicules \u00e0 clathrine, dont le rev\u00eatement est form\u00e9 de l’association d’adaptines et de trisk\u00e9lions. Le transfert du trans-Golgi aux lysosomes est direct, ou indirect avec passage par les endosomes. Les r\u00e9cepteurs du Man-6-P sont recycl\u00e9s et retournent au trans-Golgi.<\/p>\n

R\u00e9f\u00e9rences : Kaplan A, Achord DT, Sly WS Phosphohexosyl components of a lysosomal enzyme are recognized by pinocytosis receptors on human fibroblasts<\/i> (1977)
\nTabas I, Kornfeld S Biosynthetic intermediates of \u03b2-glucuronidase contain high mannose oligosaccharides with blocked phosphate residues<\/i> (1980)
\nVarki A, Kornfeld S Identification of rat liver \u03b1-N-acetylglucosaminyl phosphodiesterase capable of removing \u201cblocking\u201d: \u03b1-N-acetylglucosamine residues from phosphorylated high mannose oligosaccharides of lysosomal enzymes<\/i> (1980)
\nHasilik A, Neufeld EF Biosynthesis of lysosomal enzymes in fibroblasts. Phosphorylation of mannose residues<\/i> (1980)
\nHasilik A, Klein V, Waheed A, Strecker G, von Figura K Phosphorylated oligosaccharides in lysosomal enzymes: identification of \u03b1-N-acetylglucosamine(1) phospho(6) mannose diester groups<\/i> (1980)
\nVarki A, Kornfeld S Purification and characterization of rat liver \u03b1-N-acetylglucosaminyl phosphodiesterase<\/i> (1981)
\nWaheed A, Hasilik A, von Figura K Processing of the phosphorylated recognition marker in lysosomal enzymes: characterization and partial purification of a microsomal \u03b1-N-acetylglucosaminyl phosphodiesterase<\/i> (1981)
\nPohlmann R, Waheed A, Hasilik A, von Figura K Synthesis of phosphorylated recognition marker in lysosomal enzymes is located in the cis part of Golgi apparatus<\/i> (1982)
\nGoldberg DE, Kornfeld S Evidence for extensive subcellular organization of asparagine-linked oligosaccharide processing and lysosomal enzyme phosphorylation<\/i> (1983)
\nVarki A, Sherman W, Kornfeld S Demonstration of the enzymatic mechanisms of \u03b1-N-acetyl-d-glucosaminidase (formerly called \u03b1-N-acetylglucosaminylphosphodiesterase) and lysosomal \u03b1-N-acetylglucosaminidase<\/i> (1983)
\nLazzarino DA, Gabel CA Biosynthesis of the mannose 6-phosphate recognition marker in transport-impaired mouse lymphoma cells: demonstration of a two-step-phosphorylation<\/i> (1987)
\nRohrer J, Kornfeld R Lysosomal Hydrolase Mannose 6-Phosphate Uncovering Enzyme Resides in the trans-Golgi Network<\/i> (2001)
\nGorelik A, Illes K, Nagar B Crystal Structure of the Mannose-6-Phosphate Uncovering Enzyme<\/i> (2020)<\/span><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

Complexe de Golgi \u00ab No cellular organelle has been the subject of as many, as long-lasting, or as diverse polemics as the Golgi apparatus. \u00bb William Gordon Whaley Une existence controvers\u00e9e En 1865, Adolph J.H.F. von La Valette-Saint George, professeur d\u2019anatomie \u00e0 l\u2019Universit\u00e9 de Bonn, d\u00e9crit le Nebenk\u00f6rper (l\u2019appareil de Golgi ?) dans les cellules sexuelles de … Continue reading Chapitre 7<\/span> →<\/span><\/a><\/p>\n","protected":false},"author":3,"featured_media":0,"parent":0,"menu_order":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","template":"","meta":{"_monsterinsights_skip_tracking":false,"footnotes":""},"class_list":["post-3693","page","type-page","status-publish","hentry"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/3693","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages"}],"about":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/types\/page"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/users\/3"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=3693"}],"version-history":[{"count":5,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/3693\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":17765,"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/pages\/3693\/revisions\/17765"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/perso.uclouvain.be\/alain.amar-costesec\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=3693"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}