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Le microscope optique

La cytologie est la branche de la biologie consacrée à l’étude de la structure et des fonctions des cellules ; elle procède par l’examen microscopique de coupes de tissus fixées et colorées. L’œil humain est un organe que l’on peut assimiler à un instrument d’optique. Son pouvoir de résolution est de 200 micromètres. Les cellules, dont la taille est généralement comprise entre 10 et 20 micromètres, ne sont pas observables à l’œil nu. Leur examen nécessite le recours à un outil, le microscope optique, apparu au début du XVII^e siècle et perfectionné au XIX^e. C’est à cette époque que la cytologie s’individualisa en une branche autonome de la biologie.

Le pouvoir grossissant des lentilles de verre convexes était connu depuis l’Antiquité. Dans un traité rédigé au II^e siècle à Alexandrie, Claudius Ptolémée abordait les problèmes de réflexion et de réfraction des rayons lumineux. Les premiers microscopes apparurent au XVII^e siècle, en même temps que les premières lunettes astronomiques. A la base, le principe est le même : il faut disposer de manière adéquate des lentilles dans un tube. Au XIII^e siècle, Vénitiens et Florentins vendaient des lunettes pour corriger la myopie ou la presbytie et, vers 1450, ils commencèrent à maîtriser l’assemblage de lentilles biconcaves. Si l’on se pose la question de savoir qui a inventé le microscope, il semble que dans le milieu des polisseurs de lentilles et des fabricants de lunettes qui prospérait aux Pays-Bas à la fin du XVI^e siècle et au début du XVII^e, Zacharias Janssen et son fils Hans aient joué un rôle prépondérant. Ils auraient disposé dès 1590 des lentilles dans un tube et constaté que cet assemblage permettait d’obtenir un grossissement des objets examinés. Le microscope construit en 1595 était formé de deux lentilles dans des tubes coulissants ; le grossissement obtenu était de 10 X. L’on a retrouvé la trace écrite de querelles de priorité et d’antériorité des brevets, les héritiers de Zacharias Janssen ayant intenté une action en justice pour faire reconnaître l’antériorité de sa découverte. En 1655, à la lumière des résultats de l’enquête menée par les autorités de Middelburg, celles-ci accréditèrent le rôle des Zacharias père et fils dans la découverte du microscope (terme qui n’apparut qu’au milieu du XVII^e siècle).

Des lunettes d’observation et des microscopes furent construits et proposés aux amateurs par Jacob Metius, d’Alkmaar, Hans (ou Johann) Lippershey, de Middelburg, ou Cornelis Jacobszoon Drebbel. L’occhiolino de Galileo Galilei, dit Galilée (1609) comprenait une lentille convergente et une lentille divergente. Des microscopes furent conçus en 1618 par l’astronome Francesco Fontana ; en 1646, par le professeur de physique et de mathématiques Athanasius Kircher (Collège romain). Robert Hooke commença par construire un microscope comportant des lentilles convergentes dans un tube en bois, avant de confier la construction de ses microscopes à l’opticien londonien Christopher Cock. L’objet, éclairé par la lumière d’une lampe à huile, condensée par des loupes, était grossi de 30 à 50 X.

Référence : Kircher A Ars magna Lucis et Umbrae (1646)

A partir du XVII^e siècle, le microscope optique allait être le seul outil d’investigation des amateurs de Sciences Naturelles. Il en existait de deux sortes : le microscope simple (une loupe) et le microscope composé, dont l’aspect nous est familier : un tube métallique muni à son extrémité inférieure d’une lentille servant d’objectif ; à l’extrémité supérieure une autre lentille fait office d’oculaire ; un condenseur focalise la lumière (autrefois, celle d’une bougie ou d’une lampe à huile) sur l’objet à examiner. Les défauts des premiers microscopes composés étaient tels que les Naturalistes en abandonnèrent l’usage peu après sa découverte ; le flou des images observées les rendait inutilisables. Avec des connaissances en optique géométrique limitées et largement empiriques, en particulier en ce qui concerne la réfraction (la déviation subie par un rayon lumineux passant d’un milieu transparent à un autre), le problème de la correction des aberrations des lentilles ne risquait pas de trouver de solution. D’autre part, les microscopes manquaient de stabilité et présentaient des défauts d’alignement du dispositif optique ; en effet, l’oculaire et l’objectif étaient insérés dans des supports de bois ou de carton manquant de rigidité. Le problème fut partiellement résolu par l’emploi de tubes de cuivre. Au cours du XVIII^e siècle, les Naturalistes utilisèrent donc surtout des microscopes monoculaires dont les grossissements étaient supérieurs à ceux atteints avec le microscope composé, si l’on en juge par les performances des instruments fabriqués par Antonie van Leeuwenhoek qui sont parvenus jusqu’à nous.

Parti de la loupe utilisée par les drapiers pour évaluer la qualité des tissus – le compte-fils -, van Leeuwenhoek en améliora considérablement les performances. Il avait appris à polir les lentilles auprès de Johannes Huddle, qui fut aussi le maître de son contemporain Jan Swammerdam, pionnier de l’examen microscopique des êtres vivants. Leeuwenhoek acquit dans ce domaine une exceptionnelle habileté, polissant des jours durant un larme de verre avec des mélanges de poudres de sa composition. Des centaines de microscopes qu’il construisit durant sa longue vie (il mourût à 90 ans !), ceux qui existent encore se trouvent dans les musées et les collections de sociétés savantes. Ils sont équipés d’une lentille biconvexe à très courte distance focale ne présentant pas d’aberration chromatique ! (voir plus loin). Ces microscopes se présentent sous la forme d’une double plaque de cuivre percée d’un trou dans lequel est logée la lentille ; face à cette ouverture, une pointe métallique sur laquelle était fixé l’échantillon à observer est mue par une vis permettant d’ajuster sa position face à la lentille et à l’œil de l’observateur. Les observations se faisaient à la lumière du jour ou d’une petite lampe à pétrole. Certains de ces instruments permettent d’atteindre des grossissements de 200 à 400 X ! une performance remarquable si l’on songe que les grossissements obtenus avec les microscopes composés ne dépassaient pas 20 à 40 X ; il faudra attendre un siècle et demi après la disparition du génial Hollandais pour atteindre des performances équivalentes avec des microscopes composés.

Au cours de la première moitié du XVII^e siècle, les œuvres de trois physiciens et mathématiciens, Willebrord Snell van Royen, René Descartes et Pierre de Fermat, firent progresser significativement les connaissances dans cette branche de la physique que l’on appelle « optique géométrique ». Au départ est l’énoncé du principe de propagation en ligne droite de la lumière dans les milieux transparents. Les progrès se firent dans trois domaines : (i) la réflexion de la lumière : le changement de direction, sans changement de milieu, subit par un rayon lumineux qui rencontre une surface (miroir) ; (ii) la réfraction de la lumière : le passage d’un un rayon lumineux d’un milieu homogène à un autre milieu homogène donne naissance à un rayon transmis et un rayon réfléchi ; (iii) la diffraction : l’étalement de la lumière, qui se déplaçait en ligne droite, lorsqu’elle rencontre un obstacle ou une ouverture de faible diamètre. La contribution apportée par Descartes est exposée en partie dans l’opuscule intitulé « Dioptrique », qu’il a publié en 1637, en même temps que son Traité ; il contenait des erreurs qui furent relevées par Fermat. Snell van Royen apporta une contribution significative à l’énoncé des lois sur la diffraction ; ses résultats n’ayant jamais été publiés de son vivant, les lois de Snell-Descartes furent popularisées par le physicien Christian Huygens. La contribution de Fermat réside essentiellement dans le principe fondamental de l’optique géométrique qui décrit la forme du chemin optique d’un rayon lumineux : la lumière se propage d’un point à un autre sur des trajectoires telles que la durée du parcours soit extrémale. Le « principe de Fermat » permet de retrouver la plupart des résultats de l’optique géométrique, en particulier les lois de la réflexion sur les miroirs et les lois de la réfraction portant sur le trajet de la lumière dans des milieux d’indices différents (air et verre, par exemple).

Références : Descartes R Discours de la méthode pour bien conduire sa raison et chercher la vérité dans les sciences (1637)
Fermat P Methodus ad disquirendam maximám et minimam (1637)
Huygens C Dioptrica (1685)

Malgré ces progrès, un problème majeur l’imitait l’utilisation du microscope composé ; on n’était pas encore parvenu à corriger les défauts des lentilles appelés « aberrations » ; ils provoquent d’importantes distorsions de l’image de l’objet examiné. Pour rappel, s’agissant d’un instrument d’optique, le terme « aberration » désigne toute déformation ou manque de netteté de l’image du spécimen observé. Une loi de Descartes stipule que les rayons lumineux issus d’un objet ponctuel ne convergent que rarement en une image ponctuelle. L’écart entre l’image idéale et l’image formée par l’instrument d’optique constitue une aberration. Deux formes d’aberrations sont particulièrement gênantes : (i) l’aberration sphérique, la forme la plus courante d’aberration géométrique, est inhérente à la géométrie des lentilles ; les rayons lumineux parallèles à l’axe optique et passant à proximité du centre d’une lentille convergente et ceux passant à la périphérie ne convergent pas en un même point ; (ii) l’aberration chromatique, ou achromatisme, se manifeste par l’obtention de plusieurs images correspondant aux différentes longueurs d’onde de la lumière éclairant l’objet examiné ; in fine, l’observateur voit une image irisée parce que l’indice de réfraction du verre des lentilles varie avec la longueur d’onde de la lumière incidente, c’est-à-dire avec les différentes couleurs de l’objet. Même dans le cas d’un microscope photonique dont les lentilles ne souffrent d’aucune aberration, nous savons depuis les travaux de Louis de Broglie que la nature ondulatoire de la lumière impose une limite au pouvoir séparateur. Les phénomènes de diffraction inhérents aux dispositifs optiques font que l’image d’un point lumineux est un cercle dont la luminosité décroit du centre vers la périphérie.

Malgré ses imperfections, le microscope optique fut l’outil de pionniers comme le naturaliste Jan Swammerdam ou le maître drapier et fonctionnaire échevinal Antonie van Leeuwenhoek, des contemporains du peintre Johan Vermeer, du philosophe Baruch Spinoza (qui assurait sa survie en polissant des lentilles) et du médecin et anatomiste Reinier (Regnerus) de Graaf, découvreur des follicules ovariens chez les mammifères. Van Leeuwenhoek était un habile polisseur de lentilles et constructeur de microscopes. La vocation scientifique de van Leeuwenhoek naquît peut-être au cours de son séjour à Londres, le seul voyage qu’il fit hors des Pays-Bas, pendant lequel il aurait consulté l’ouvrage à succès de Robert Hooke.

Référence : Hooke R Micrographia, or some physiological descriptions of minute bodies made by magnifying glasses with observations and inquiries thereupon (1665)

L’aberration chromatique fut le premier défaut à être corrigé. Au XVIII^e siècle (1729), Chester M. Hall, juriste et fabricant de lunettes astronomiques, parvint à combiner des lentilles achromatiques. Avant de quitter cette époque, je dois signaler que le microscope binoculaire apparut après 1722. Au XIX^esiècle, Joseph J Lister, quacker par conviction, marchand de vin par nécessité, amateur d’optique et de sciences naturelles par inclination, soumit à la Royal Society un mémoire dans lequel il décrivait la réalisation d’objectifs dont le chromatisme était réduit. Il fabriqua des lentilles en combinant du verre optique flint avec du verre crown ; le premier, riche en plomb et en métaux lourds provoque une forte dispersion de la lumière ; le second a un pouvoir dispersif plus faible.

Référence : Lister JJ On Some Properties in Achromatic Object-Glass Applicable to the Improvement of the Microscope (1830)

Dans le domaine de la microscopie, je dirai, en schématisant un peu, qu’il y a un avant et un après Giovanni Batista Amici. Au début du XIX^e siècle, les innovations apportées par cet astronome et professeur de mathématiques à l’Université de Modène conduisirent à l’essor de l’observation microscopique des tissus et des cellules, et à la naissance d’une nouvelle branche de la science : la Cytologie. En 1844, il fit, une tournée des capitales européennes, en commençant par Paris, pour promouvoir un nouveau microscope dans lequel il était parvenu à corriger partiellement les aberrations sphériques et chromatiques. Après la démonstration faite à Londres, et quatre ans avant de découvrir le noyau, Robert Brown acquit un microscope conçu selon les spécifications d’Amici. Le microscope utilisé par Theodor Schwann, dans le laboratoire de Johannes Peter Müller, fut construit par l’opticien viennois Simon Plössl selon les spécifications d’Amici. La Théorie cellulaire est l’œuvre de microscopistes. La contribution d’Amici ne s’arrêta pas à la construction de quelques 300 microscopes. En 1847, il introduisit l’immersion de l’objectif dans une huile transparente. En augmentant l’ouverture numérique – ouverture grand angle – on augmente le pouvoir de résolution et la luminosité de l’image, permettant ainsi l’observation de nouveaux détails. D’autres opticiens, au XIX^e siècle, rivalisèrent de savoir-faire et d’ingéniosité pour produire des instruments performants : à Vienne, Simon Plössl, élève de Friedrich von Voigtlaender, Georg Merz, en Bavière, élève du physicien et opticien Joseph von Fraunhofer, Pistor & Schick, à Berlin. Leurs instruments, pieusement conservés dans les musées et les collections, ont acquis le statut d’œuvres d’art. En 1884, Ernst Abbe, Otto Schott et Carl Zeiss créèrent la verrerie Jenaer Glasswerke Schott & Geossen. En 1889, en utilisant les verres fabriqués par Schott, Abbe conçut un objectif apochromatique, c’est-à-dire corrigé des aberrations chromatique et sphérique pour certaines longueurs d’onde.

Jusqu’à l’orée du XX^e siècle, les années de progrès, d’innovations et de découvertes en Cytologie sont en grande partie l’héritage d’Amici. En 1900, une sorte de limite fut atteinte : les principaux organites subcellulaires avaient été découverts ; il n’y avait plus de progrès significatifs à attendre de la microscopie dans le domaine de l’anatomie de la cellule. En cause, principalement la limitation imposée par la longueur d’onde de la lumière utilisée.

Le microscope optique à transmission (ou microscope photonique) de base est équipé d’une lentille « objectif », qui agrandit l’objet, et d’une lentille « oculaire ». Les deux caractéristiques d’un microscope sont sa puissance optique et sa résolution, c’est-à-dire la distance minimum entre deux objets que l’on peut distinguer l’un de l’autre. En 1873, le physicien Ernst Carl Abbe établit la formule permettant de calculer le pouvoir de résolution d’un instrument d’optique :

d = 0,61 λ / n.sin α

où d est la distance séparant deux points donnant deux images distinctes, λ, la longueur d’onde de la lumière de la source, n l’indice de réfraction du milieu (il est de 1 dans le vide) et α la demi-ouverture angulaire de l’objectif. On peut augmenter la résolution d’un microscope en optimisant les trois variables : λ, n, α. La résolution étant inversement proportionnelle à la longueur d’onde de la lumière incidente, on ne peut pas aller au-delà de λ = 400 nm (lumière violette). En ce qui concerne l’ouverture numérique (n sin α), l’introduction d’une goutte d’huile d’indice de réfraction 1,56 entre l’objectif et l’objet augmente l’indice de réfraction, c’est à dire le rapport entre la vitesse de la lumière dans le milieu entre l’échantillon et l’objectif, et la vitesse de la lumière dans l’air. Abbe a introduit une grandeur essentielle en optique oculaire : le rapport entre la réfraction et la dispersion, baptisé en son honneur « nombre d’Abbe ». Avec un microscope dont on a porté l’ouverture numérique à une valeur proche de 1,7, on atteint un grossissement de 2.500 X et une résolution de 200 nm.

Je reviendrai plus loin sur ce concept de limite théorique de résolution du microscope optique. Sous certaines conditions, cette limite peut être franchie, comme l’ont montré les physiciens Stefan W. Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) et R. Eric Betzig (University of California, Berkeley), et le physico-chimiste William E Moerner (IBM Research Division Almaden Research Center, San Jose, California). Avec la « Microscopie par Molécule individuelle » (Single-molecule Microscopy) d’Eric Betzig et William Moerner, ou la « Déplétion par Emission stimulée » (Stimulated Emission Depletion) de Stefan Hell, la limite théorique de résolution a été franchie. Hell, Betzig et Moerner ont reçu le prix Nobel de chimie 2014.

Références : Betzig E, Harootunian A, Lewis A, Isaacson M Near-field diffraction by a slit: implications for superresolution microscopy (1986)
Betzig E, Lewis A, Harootunian A, Isaacson M, Kratschmer E Near Field Scanning Optical Microscopy (NSOM): Development and Biophysical Applications (1986)
Moerner WE, Kador L Optical detection and spectroscopy of single molecules in a solid (1989)
Hell SW, Wichmann J Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy (1994)

Toute observation microscopique requiert un traitement préalable de l’échantillon à examiner. Au XVII^e siècle, les techniques de fixation, coupe et coloration étaient rudimentaires. Chaque naturaliste possédait ses recettes et, le plus souvent, se gardait bien d’en faire profiter ses confrères ; de ce point de vue, van Leeuwenhoek ne fut pas en reste. Le vinaigre de vin était couramment utilisé pour « fixer » les échantillons biologiques ; ceux que l’on voulait maintenir en survie étaient scellés dans des capillaires en verre pour éviter l’évaporation (c’est ainsi que van Leeuwenhoek observa le mouvement des infusoires). L’ampoule contenant le spécimen était maintenue par une boule de cire à la pointe d’une tige filetée, ce qui permettait de placer l’objet à la hauteur de l’axe optique de la lentille et de l’œil. Les échantillons fixés devaient être débités en coupes de faible épaisseur, car au-delà d’une certaine épaisseur de coupe le passage des rayons lumineux est entravé. Van Leeuwenhoek était un virtuose du rasoir : il parvenait à obtenir des coupes dont l’épaisseur n’excédait pas 100 micromètres ! Cet autodidacte était doté d’un esprit méthodique, je dirai même « scientifique ». Orphelin de bonne heure, et de condition modeste, il n’avait pas eu le loisir de faire de longues études. Lorsqu’il se livrait à ses observation microscopiques, il consignait soigneusement ses résultats par écrit : origine du prélèvement examiné, saison, température, éclairement. En outre, il adopta une attitude scientifique en faisant varier les conditions expérimentales de manière systématique. Introduit auprès de la Royal Society de Londres par son compatriote Regnerus de Graaf, il y communiqua le résultat de ses observations dans 375 lettres agrémentées de dessins, bien qu’il fût un piètre dessinateur. Il envoya aussi 27 lettres à l’Académie des Sciences de Paris. Van Leeuwenhoek ne connaissait pas le latin, la langue des échanges entre savants. Ses lettres en néerlandais furent traduites en anglais et en latin par les membres de la Royal Society et publiées dans les Philosophical Transactions, la revue créée en 1665. Elles furent plus tard regroupées et publiées en quatre volumes sous le titre : « Arcana naturae ope et beneficio exquisitissorum microscopiorum detecta, variisque experimentis demonstrata ab Antonio a Leeuwenhoek ».

Note : Pour la rédaction de ce sous-chapitre je me suis en partie inspiré du texte présenté par Albert Claude au Symposium on Electron Microscopy, qui s’est tenu à Modena, en avril 1963.

Le microscope à contraste de phase

Comme son nom l’indique, le microscope à contraste de phase exploite les changements de phase d’un faisceau lumineux traversant l’objet à observer, par rapport à un faisceau lumineux de référence. Le principe en a été inventé en 1932 par Frederik Zernike (Rijksuniversiteit Groningen, prix Nobel de physique 1953) ; son application à la microscopie, en 1941, est l’œuvre d’August K.J.V. Köhler (Carl Zeiss AG, Iéna), l’inventeur de l’illuminateur qui porte son nom, et qui a révolutionné le mode d’éclairement de l’objet. Ce microscope à transmission permet l’observation d’objets non colorés, transparents et de faible épaisseur, par exemple des tissus ou des cellules étalées sur un support solide transparent. Les différentes structures cellulaires – noyau, organites, cytosol – ont des indices de réfraction légèrement différents. Je rappelle que la vitesse de la lumière varie en fonction de l’indice de réfraction du milieu ; elle diminue lorsque l’indice augmente. Devant la source lumineuse est placé un condenseur dont le plan focal est occupé par un diaphragme annulaire ; un anneau dit « de phase » occupe le plan focal de l’objectif. Le cône de lumière issu de l’anneau circulaire du condenseur est superposé à un anneau de taille similaire issu de l’anneau de phase de l’objectif – qui crée une différence de phase d’un quart de longueur d’onde. La recombinaison du faisceau qui a traversé l’échantillon avec un faisceau de référence provoque des interférences. Les différences d’indices de réfraction entre structures cellulaires se traduisent par un décalage de phase du faisceau lumineux qui les traverse. Ce changement de phase n’est pas perceptible par l’œil humain ; pour l’observer on le transforme en différences d’amplitude (transformation de l’« objet de phase » en « objet d’amplitude »). L’œil humain perçoit des différences de niveaux de contraste – zones claires, zones sombres.

Références : Zernike F Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung (1935)
Köhler A Ein neues Beleuchtungsverfahren für mikrophotographische Zwecke (1893)
Köhler A New Method of Illumination for Photomicrographical Purposes (1894)
Köhler A, Loos W Das Phasenkontrastverfahren und seine Anwendungen in der Mikroskopie (1941)

La microscopie à contraste interférentiel (Differential Interference Contrast (DIC) microscopy, Nomarski Interference Contrast (NIC) microscopy) corrige un défaut de la microscopie à contraste de phase en supprimant le halo autour de l’image de l’objet examiné. Cette technique permet d’augmenter le contraste d’objets transparents non colorés (cellules vivantes) ; l’examen d’objets d’une certaine épaisseur, comme le noyau cellulaire, donne des images de qualité avec un degré de résolution élevé (jusqu’à 460 nm). En 1947, Francis Hughes Smith apporta une contribution importante à la microscopie à contraste interférentiel en introduisant l’usage de prismes de Wollaston pour séparer et recombiner les faisceaux lumineux. En effet, dans ce type de microscope, le faisceau de lumière non polarisée issu de la source lumineuse est transformé en lumière polarisée à 45° par un filtre de polarisation ; après passage par un prisme de Wollaston, il en ressort deux faisceaux parallèles et de polarisations orthogonales (0° et 90°) ; les deux faisceaux sont dirigés vers l’objet transparent par une lentille de condensation. En fonction des différences d’épaisseur ou d’indice de réfraction des structures de l’objet, les deux faisceaux présentent différentes longueurs de trajet optique. La lentille objectif envoie les deux faisceaux polarisés perpendiculairement et déphasés vers un second prisme de Wollaston situé dans le plan focal de l’objectif. Techniquement, ce dernier détail présente de grandes difficultés de réalisation. Elles furent solutionnées par Georges Nomarski (Institut d’optique, Paris) qui modifia la conception du prisme de Wollaston. C’est pour cette raison que les premiers microscopes à contraste interférentiel différentiel, produits par la firme Carl Zeiss en 1965, portent le nom de microscopes Nomarski. Finalement, les faisceaux lumineux sont recombinés en un faisceau unique polarisé à 135° avec conversion de phase (non observable par l’œil) en amplitude (observable). Les interférences entre les deux rayons provoquent des interférences constructives (lumineuses) ou destructives (sombres), ce qui rend observables des structures à peine visibles en fond clair. La reconstruction à l’ordinateur à partir de « sections optiques » donne des images tridimensionnelles (en « pseudo relief ») ; on peut également suivre le déplacement d’organites à l’intérieur des cellules.

Note : J’ai adopté comme principe de citer les articles originaux plutôt que les articles de revue. Cependant, Francis Hughes Smith et Georges Nomarski ayant très peu publié, je dois me contenter de citer le brevet de Smith et l’article de revue de Loos :
Smith FH Interference microscope (1948)
Loos W Das Phasenkontrastverfahren nach Zernike als biologische Forschungsmittel (1941)

Médecin, chimiste et physicien, William Hyde Wollaston est l’inventeur du polariseur formé de deux prismes de quartz ou de calcite qui porte son nom ; il s’est également illustré par la découverte des éléments palladium et rhodium. Il a été élu membre, secrétaire puis président de la Royal Society de Londres.nAprès sa sortie des camps d’internement nazis de la Seconde Guerre mondiale, George Nomarski (Centre National de la Recherche Scientifique, Saclay) entra à l’Université Catholique de Louvain puis à l’École Supérieure d’Optique de Paris.

Le microscope électronique en transmission

La grande révolution qu’attendaient les Cytologistes se produisit un peu plus d’un siècle après la tournée européenne de Giovanni Battista Amici, en 1844 : ce fut l’invention du microscope électronique par Ernst A.F. Ruska (prix Nobel de physique 1986), au cours des années 1930 à 1934, mais qui ne fut opérationnel dans les laboratoires que dans les années 1950. Le caractère ondulatoire de la lumière fut découvert par Christiaan Huygens à la fin du XVII^e siècle. La nature de la lumière et de son interaction avec la matière fut un sujet de préoccupation pour les physiciens de la première moitié du XX^e siècle ; dans certaines conditions, la lumière se comporte comme une particule (effet photoélectrique), dans d’autres, comme une onde. En 1923, Louis de Broglie (prix Nobel de physique en 1929) interpréta la dualité onde-particule en formulant l’hypothèse qu’à toute particule ayant une quantité de mouvement on peut associer une longueur d’onde :

λ= h/mv

(h) étant la constante de Planck, (m) la masse de la particule et (v) sa vitesse. Les résultats obtenus par de Broglie sur la mécanique quantique s’ajoutant à ceux d’Albert Einstein (prix Nobel de physique 1921) et de Niels Bohr (prix Nobel de physique en 1922) sur les théories quantique et atomique permirent les rapides progrès de la physique corpusculaire, de l’électronique appliquée et de l’optique quantique dans la première moitié du XX^e siècle. Dès lors, des travaux sur la possibilité de développer un microscope utilisant l’onde associée aux électrons commencèrent dans un certain nombre de pays.

Références : Huygens C Traité de la Lumière (1690)
Einstein A Über einen die Erzeugung und Verwandlung des Lichtes betreffenden heuristischen Gesichtspunkt (1905)
De Broglie L Ondes et mouvements (1926)
Bohr N Le postulat quantique et le dernier développement de théorie atomique (1927)

Chose surprenante, c’est en France que le développement d’un microscope électronique souleva le moins d’intérêt. Louis de Broglie était un pur théoricien ; ne disposant pas de laboratoire à l’Institut Henri Poincaré ou au Collège de France, il en avait installé un dans sa demeure. Il l’agrandit en lui allouant un étage de son habitation et y effectua des travaux sur la diffraction des rayons X. Un de ses élèves, Jean-Jacques Trillat, professeur de physique à la Faculté des Sciences de l’Université de Besançon, construisit un microscope en 1935 avec les modestes moyens dont il disposait. Aucune micrographie ne fut prise avec cet instrument. En 1936, son assistant, R. Fritz publia un article dans la Revue générale scientifique mettant l’accent sur l’intérêt de la microscopie électronique. Aucune mention n’est faite de ces travaux dans le recueil paru en 1946 : « L’optique électronique. Réunions d’études et de mises au point tenues sous la présidence de Louis de Broglie ». Dans la préface, de Broglie essaya de justifier le fait que l’invention du microscope électronique n’ait pas eu lieu en France : « L’optique électronique aurait pu avoir en France son développement initial. Dès 1927-1928, je signalais à l’un de mes premiers élèves l’intérêt qu’il y aurait à développer l’optique géométrique des électrons. Malheureusement, il n’a pas poursuivi son travail dans cette direction, et moi-même, absorbé par des recherches plus générales sur la mécanique ondulatoire, je n’ai pas approfondi ces questions. » Ce n’est que dans les années 1940 que le Centre national de la recherche scientifique alloua des crédits pour construire un microscope sous la direction de Pierre Grivet (Compagnie Générale de Télégraphie sans Fil) ; trois exemplaires furent installés à l’Institut Pasteur, à l’Office national d’études et de recherches aérospatiale et chez Michelin.

Références : Trillat JJ Les preuves expérimentales de la mécanique ondulatoire. La diffraction des électrons et des particules matérielles (1934)
Trillat JJ La diffraction des électrons et ses applications (1935)

Malgré les turbulences économiques, sociales et politiques que connut la république de Weimar, le niveau scientifique général en Allemagne était bien supérieur à ce qu’il était en France, malgré la présence de quelques personnalités de premier plan comme Paul Langevin, Frédéric et Irène Joliot-Curie (tous deux prix Nobel de chimie en 1935) ou Louis de Broglie. Dans les années 1920, Berlin était la Mecque de la physique ; s’y côtoyaient des sommités telles que Max von Laue, (prix Nobel de physique 1914), Max Planck (prix Nobel de physique 1918), Walther Nernst (prix Nobel de chimie 1920), Albert Einstein (prix Nobel de physique 1921). Dans leur sillage, se constitua un groupe de jeunes et talentueux physiciens. En 1926, l’un d’entre eux, Hans Busch, publia dans Annalen der Physik un article décrivant la focalisation d’un faisceau d’électrons par un champ magnétique. L’ingénieur Dennis Gabor (prix Nobel de physique 1971 pour la découverte de l’holographie), qui faisait sa thèse à la Technische Universität, Berlin Charlottenburg, parvint à la même conclusion et construisit la première lentille magnétique. Cette découverte ouvrit la voie à la conception de lentilles électrostatiques produisant un champ électrique capable de focaliser des faisceaux de particules chargées (ions et électrons). Les premières versions du microscope électronique furent équipées de lentilles électrostatiques. Leur utilisation sous des tensions supérieures à 100 kilovolts posait des problèmes pratiques ; ces lentilles souffrant d’aberration sphérique, leur usage fut limité aux canons à électrons ; pour les microscopes, elles furent remplacées par les lentilles magnétiques qui ne focalisent que les faisceaux d’électrons.

Référence : Busch H Berechnung der Bahn von Kathodenstrahlen im axialsymmetrischen elektromagnetischen Felde (1926)

En 1931, Léo Szilard, qui fut l’assistant de Max von Laue, fit un rapprochement entre le travail de Hans Busch et la théorie de la mécanique ondulatoire. L’équation de de Broglie appliquée à un faisceau incident d’électrons prédit que la longueur d’onde sera d’autant plus petite que la vitesse des électrons est plus grande. Avec des électrons accélérés sous un potentiel de 10 kilovolts, la longueur d’onde théorique est de l’ordre de l’Angström (0,1 nm ou 100 picomètres), ce qui est l’ordre de grandeur des liaisons chimiques. Ernst Ruska, qui travaillait sous la direction de l’ingénieur électricien Max Knoll (Technische Hochschule, Berlin), prit aussi connaissance de l’article de Busch et entreprit la conception d’un microscope. Il ne fut pas le seul à tenter l’aventure : une compétition s’engagea avec l’équipe d’Ernst Brüche (Allgemeine Elekticitäts-Gesellschaft). De 1931 à 1933, Knoll et Ruska construisirent un prototype dans lequel le faisceau d’électrons était accéléré par une différence de potentiel entre deux électrodes, puis focalisé sur une cible par des aimants faisant office de lentilles électromagnétiques ; l’image d’une grille métallique était recueillie sur un écran. Le pouvoir de résolution, de l’ordre de la centaine de nm, dépassait à peine celui d’un microscope optique. Ce prototype est conservé au Deutsches Museum, à Munich. Malgré ces résultats décevants, une demande de brevet fut déposée par Reinhold Rudenberg, directeur scientifique des usines Siemens & Halske AG – du nom des fondateurs, en 1847, Werner von Siemens et Johan Georg Halske. En 1937, Rudenberg obtint de sa direction le financement nécessaire à la poursuite des travaux. Le microscope construit par Ruska et l’ingénieur électricien Bodo von Bories atteignait une résolution de 10 nm ; il fut commercialisé en 1938. Le travail de pionnier d’Ernst Ruska sera récompensé (cinquante ans plus tard !) par l’attribution du prix Nobel de physique 1986. La limite de résolution du microscope électronique en transmission du Centre Ernst-Ruska, à Julich, est de 50 picomètres (0,05 nm). A titre de comparaison, la limite de résolution de l’œil humain est de 100 µm (avec une lumière visible de 380 à 670 nm), et celle du microscope photonique, de l’ordre de 200 nm.

En 1933, Louis Marton quitta le groupe des physiciens de Berlin pour rejoindre le laboratoire d’Émile Henriot et A. Picard à l’Université libre de Bruxelles. Entre 1934 et 1937, il construisit un microscope électronique et publia le résultat de ses travaux dans le Bulletin de l’Académie Royale des Sciences de Belgique. Faute de financement de la part des autorités universitaires et gouvernementales, le projet fut abandonné et, en 1938, Marton partit pour les Etats-Unis. Il fut engagé par la firme Radio Corporation of America (RCA) de Princeton, où il participa à la construction d’un microscope électronique (1940). Ce prototype fut perfectionné par Vladimir Zworykin, pionnier de la télévision, et par James Hillier, un transfuge de l’Université de Toronto, embauché par RCA. Deux ans plus tôt, en 1938, le groupe du physicien Eli Franklin Burton (auquel appartenait Hillier) avait construit à Toronto le premier microscope électronique d’Amérique du Nord.

Références : Busch H Berechnung der Bahn von Kathodenstrahlen im axialsymmetrischen elektromagnetischen Felde (1926)
Ruska E, Knoll M Die magnetische Sammelspule für schnelle Elektronenstrahlen (1931)

Note. Pour la rédaction de ce paragraphe, j’ai bénéficié d’informations fournies par Emmanuel De Chambost et par Pierre Hillion, un élève de Louis de Broglie.

Aberrations

Des aberrations affectent les performances des microscopes électroniques (comme c’est le cas pour les microscopes photoniques). Les défauts qui limitent la résolution des optiques électroniques sont l’aberration sphérique, l’astigmatisme et l’aberration chromatique. D’autres aberrations de moindre importance, appelées distorsions, ont un effet perturbateur limité. L’électron ayant un caractère ondulatoire, un phénomène de diffraction affecte la lentille objectif. Une lentille parfaitement sphérique devrait donner d’un objet ponctuel une image ponctuelle. Ce n’est pas le cas : l’image d’un objet ponctuel est une tache (la tache d’Airy). Ce défaut est corrigé par l’utilisation d’électrons de très courte longueur d’onde et par un élargissement de l’angle d’ouverture de la lentille objectif. En 1933, le physicien Otto Scherzer (Allgemeine Elekticitäts-Gesellschaft) avait démontré que les objectifs magnétique ou électrostatique présentent une aberration sphérique positive. Dans les lentilles magnétiques, il est difficile de contrôler la forme de la répartition spatiale de flux magnétique. Les électrons passant à distance de l’axe de symétrie de révolution subissent une force perturbatrice qui les amène à être focalisés plus près de la lentille que ceux passant à proximité de l’axe. L’image d’un objet ponctuel est un disque. Ce défaut de focalisation est minimisé par l’utilisation d’un circuit électronique additionnel modifiant la focalisation du faisceau d’électrons. On utilise des lentilles de très faible ouverture, à focale très courte (quelques mm), à grandissement élevé, excitées à un régime proche de la saturation.

L’astigmatisme des lentilles électroniques est provoqué par les obstacles matériels à la construction de lentilles à symétrie de révolution parfaite (défaut d’homogénéité des propriétés magnétiques du métal des pièces polaires, défauts d’usinage, contamination des surfaces et des diaphragmes) ; cela entraîne des différences de distance focale selon le plan passant par l’axe optique. La correction de l’astigmatisme est possible par superposition d’un champ à symétrie elliptique, à intensité et direction réglables. On sait maintenant réaliser et introduire à l’intérieur de la lentille objectif des correcteurs d’astigmatisme. Le principe en est simple : créer au moyen de petites bobines un champ équivalent à une faible lentille cylindrique de convergence et de distribution azimutale réglables de façon à compenser les défauts de la lentille principale. A la suite des travaux de François Bertein (1947), un élève de P. Grivet, un dispositif corrigeant l’astigmatisme des objectifs fut conçu et breveté (1948). Aux Etats-Unis, James Hillier conçut un stigmateur mécanique à vis qui équipa le microscope électronique à haute résolution de RCA.

L’aberration chromatique est due au fait que la distance focale d’une lentille électronique est proportionnelle à l’énergie des électrons incidents. Tout écart à la monochromaticité du faisceau d’électrons donne d’une image ponctuelle un disque. Le rayon de ce disque définit l’aberration chromatique. Ce défaut est corrigé par l’incorporation d’un dispositif de filtrage des électrons transmis. Les aberrations appelées distorsions sont caractérisées par le déplacement d’un point de l’image par rapport à sa position théorique, déplacement qui est fonction de la distance à l’axe optique. On distingue les distorsions par déplacement radial (distorsion en barillet ou en croissant) et les distorsions par déplacement tangentiel, l’angle de rotation de l’image variant avec la distance à l’axe optique. Les autres aberrations : de coma, de courbure de champ, de distorsion, n’interviennent qu’au second ordre, ou pour les lentilles de projection. Par contre, on peut aussi classer parmi les aberrations ou défauts de la lentille, même si cette dernière est parfaite, l’erreur de mise au point, ou défocalisation.

Techniques annexes

Les débuts en Biologie de la microscopie électronique furent hésitants. Tout était à inventer avec ce nouvel instrument. A Bruxelles, Marton avait envisagé d’examiner du matériel biologique au microscope électronique mais c’est à New York que la première micrographie fut prise : Claude et Ernest Fullam disposèrent une fraction subcellulaire (mitochondries) sur un film de plastique soutenu par une grille métallique. Après dessiccation complète (le microscope électronique opère sous un vide d’environ 10^-4 torr), l’échantillon fut introduit dans le microscope RCA Model EMB de la firme Interchemical Corporation, dirigée par Albert Gessler. La première micrographie électronique d’une cellule eucaryote fut réalisée. Dans le département de James Murphy (The Rockefeller Institute for Medical Research), Keith Porter était parvenu à cultiver des fibroblastes d’embryons de poulet sur film de plastique. En juillet 1944, Porter et Fullam, disposèrent sur la grille une préparation cellulaire fixée aux vapeurs de tétraoxyde d’osmium (introduit en microscopie par Marton). Après dessiccation, ils obtinrent la première micrographie d’une cellule : l’image de la partie centrale, trop épaisse, était ininterprétable ; par contre, les parties périphériques, plus minces du fait de l’étalement du fibroblaste, révélaient l’existence d’une structure réticulaire et de corps vésiculaires (reticulum endoplasmique). Cette expérience montrait qu’une bonne observation n’était possible qu’avec du matériel biologique le plus mince possible ; le pouvoir de pénétration des électrons est faible et ils sont diffractés par tous les atomes.

Références : Marton L La microscopie électronique des objets biologiques (1934)
Claude A, Fullam EF An electron microscope study of isolated mitochondria (1945)
Porter KM, Claude A, Fullam EF A Study of Tissue Culture Cells by electron microscopy: Methods and Preliminary Observations (1946)
Claude A, Porter KM, Pickels EG Electron microscope study of chicken tumor cells by electron microscopy (1947)

Le recours à la microtomie s’imposa. Ceux qui pensaient qu’une adaptation des instruments utilisés en histologie résoudrait rapidement le problème durent déchanter. Il fallut plus de dix ans pour obtenir un instrument satisfaisant. La microscopie photonique s’accommode de coupes de tissus dont l’épaisseur est de l’ordre du micromètre ; en microscopie électronique, obtenir un contraste révélant les structures subcellulaires n’est possible qu’avec des échantillons de moins de 100 nanomètres d’épaisseur. Fritiof S. Sjöstrand (Karolinska Institutet, Stockholm) commença par utiliser une laborieuse technique de recoupe de préparations de fibres musculaires. Par la suite, il modifia le microtome de la firme Spencer Lens Co pour en améliorer les performances. Des instruments furent construits par H.C. O’Brien et G.M. McKinley (University of Pittsburgh), par Fullam et A. E. Gessler (Interchemical Laboratory). C’est finalement l’instrument de Keith R. Porter et Joseph Blum (The Rockefeller Institute for Medical Research) qui s’imposa, avec un mécanisme d’avance du couteau préservant la surface du bloc à couper, et un réservoir de liquide pour recueillir les coupes par flottaison, afin d’éviter qu’elles ne se recroquevillent avant d’être déposées sur une grille métallique,. Harrison Latta et J. Francis Hartmann (Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge) introduisirent l’usage de couteaux de verre, bientôt remplacés par des couteaux en diamant, plus chers mais beaucoup plus résistants. Avec des coupes de 20 à 40 nm d’épaisseur, la résolution du microscope électronique pouvait atteindre une dizaine de nm.

Références : O’Brien HC, McKinley GM New Microtome and Sectioning Method for Electron Microscopy (1943)
Claude A, Fullam EF The preparation of sections of guinea pig liver for electron microscopy (1946)
Fullam EF, Gessler AE A high speed microtome for the electron microscope (1946)
Gessler AE, Fullam EF Sectioning for the electron microscope accomplished by the high speed microtome (1946)
Latta H, Hartmann JF Use of a Glass Edge in Thin Sectioning for Electron Microscopy (1950)
Sjöstrand F A Method for Making Ultra-Thin Tissue Sections for Electron Microscopy at High Resolution (1951)
Porter KR, Blum J A study in microtomy for electron microscopy (1953)

En même temps que le développement de la microtomie, apparut la nécessité de mettre au point des techniques de fixation et d’inclusion des tissus dans un milieu solide. Pour la fixation des tissus et des cellules, Keith Porter et Frances L. Kallman utilisèrent le tétraoxyde d’osmium. D’autres milieux furent proposés : le mélange permanganate de potassium, l’acroléine (John H. Luft, Department of Anatomy, Harvard Medical School) et la formaldéhyde (F. Blum). En 1961, David Sabatini utilisa la glutaraldéhyde, qui présente un double avantage : (i) l’activité des enzymes est préservée ; (ii) ce milieu a un meilleur pouvoir de pénétration dans les tissus que l’acide osmique et permet de fixer des échantillons volumineux. George Palade porta son choix sur le tétraoxyde d’osmium ; cet oxydant puissant interagit avec les acides gras des phospholipides ; les membranes cellulaires, rendues opaques aux électrons, apparaissent sous forme de lignes noires sur fond clair. L’acidité provoquant la formation d’artefacts dans les tissus, Palade dilua l’acide osmique dans le tampon acétate/véronal de Michaelis (pH 7,2 à 7,6). Le « milieu de Palade », mis au point en 1952, fut universellement adopté.

Références : Palade GE A study of fixation for electron microscopy (1952)
Porter K, Kallman F The properties and effects of osmium tetroxide as a tissue fixative with special reference to its use for electron microscopy (1953)
Luft JH Permanganate—a new fixative for electron microscopy (1956)
Luft JH The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy (1959)
Claude A. Problems of fixation for electron microscopy. Results of fixation with osmium tetroxide in acid and alkaline media (1961)

Différents milieux d’inclusion furent essayés dans le but d’obtenir des coupes ultra-fines. Un premier progrès fut accompli avec le milieu à base de méthyl ou de butyl méthacrylate, proposé par Newman, Borysko et Swerdlow, qui se solidifie par dessiccation au four. L’usage du méthacrylate se heurte cependant à des problèmes : la polymérisation n’est pas uniforme et provoque une déformation des objets, particulièrement dans le cas de bactéries ; il est instable sous un faisceau d’électrons ; il peut se former des bulles autour du spécimen. En 1956, Audrey M Glauert (Strangeways Research Laboratory, University Chemical Laboratory, Cambridge) apporta la solution avec l’introduction des résines époxy.

Références : Newman SB, Borysko E, Swerdlow M New Sectioning Techniques for Light and Electron Microscopy (1949)
Glauert AM, Rogers GE, Glauert RH A New Embedding Medium for Electron Microscopy (1956)
Glauert AM, Glauert RH Araldite as an Embedding Medium for Electron Microscopy (1958)
Luft JH Improvements in epoxy resin embedding methods (1961)

Le microscope électronique, grâce à son rapport de grossissement utile de 50.000 fois, se révéla un incomparable outil de découvertes : structure fine des mitochondries et du complexe de Golgi, vésicules microsomiales, ribosomes… Avec les nouveaux outils développés sous l’impulsion d’Albert Claude : le fractionnement subcellulaire quantitatif et l’examen au microscope électronique des cellules et de leur contenu, l’étude des relations entre structure et fonction devint un thème de recherche prioritaire. En 1960, un groupe de biologistes, sous la houlette de Keith Porter, fondèrent l’American Society for Cell Biology. Don W. Fawcett en fut nommé président au cours de la réunion qui se déroula à Chicago en novembre 1961. A l’initiative de Detlev Bronk, directeur du Rockefeller Institute, le véhicule d’expression de la société fut The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. Le premier numéro parut en 1955 ; son titre fut changé en 1962, et devint : The Journal of Cell Biology. A la demande de George Palade et de Keith Porter, une attention particulière fut apportée à la qualité de reproduction des micrographies.

Note : Pour la rédaction de ce sous-chapitre, je me suis inspiré en partie de l’article publié par George E. Palade, en 1971, dans The Journal of Cell Biology : Albert Claude and the Beginnings of Biological electron microscopy.

Microscope électronique à balayage

Dès 1930, Max Knoll et Manfred von Ardenne, un physicien autodidacte, pressentirent les possibilités ouvertes par une optique quantique basée sur l’onde de de Broglie, mais ne disposant pas de détecteurs adéquats, ils ne purent mener à terme la construction d’un microscope électronique. En 1935, Knoll (Telefunken Company) conçut un instrument permettant de visualiser la surface d’un objet. Il avait montré qu’en variant le courant alimentant les bobines électrostatiques faisant office de lentille on fait varier la focalisation des électrons ; on obtient alors un faisceau d’électrons qui balaye la surface de l’échantillon au lieu de le pénétrer, comme en microscopie électronique en transmission. A une extrémité de son analyseur (un pseudo microscope), l’échantillon, placé dans un tube de verre scellé, recevait en surface un flux d’électrons issu d’un canon, sous une tension de 500 à 4 000 Volts. Le faisceau parcourt la surface de l’échantillon sous l’effet de la déflection que lui imposent les bobines. L’échantillon impacté émet des électrons qui, après amplification et modulation, produisent une image. Le grandissement était de 10. Von Ardenne appliqua la découverte de Knoll au microscope électronique. En 1937 et 1938, dans son laboratoire privé de Berlin-Lichterfelde (Forschungslaboratorium für Elektronenphysik), il installa des bobines à balayage dans un microscope en transmission mais il dut interrompre ses travaux à l’arrivée de la guerre.

Références : Knoll M Aufladen Potentiel und Sekundäremission elektronen bestrahlter Körper (1935)
von Ardenne M Das Elektronen-Rastermikroskop (1938)
von Ardenne M Elektronen-Ubermikroskopie (1940)

Aux États-Unis, les physiciens Vladimir K. Zworykin, James J. Hillier et R.L. Snyder (Radio Corporation of America Laboratories, New Jersey) construisirent en 1942 un microscope électronique à balayage pour l’examen d’échantillons solides ; équipé de lentilles électrostatiques, il atteignait une résolution de 50 nm sous un potentiel de 10.000 électrons-volts. Jugeant les résultats insuffisants, la firme mit fin au projet. Un autre microscope fut conçu, dans les années 1960, par Dennis McMullen, qui faisait sa thèse (PhD) dans le laboratoire de Charles Oatley (Cambridge University). La mise au point par deux étudiants : Thomas E. Everhart et Richard F.M. Thornley (Cambridge University) d’un détecteur d’électrons secondaires de très faible énergie émis par la surface (ou par une fine couche) de l’objet, fut une contribution importante au véritable essor de la microscopie électronique à balayage. Le premier instrument fut commercialisé en 1965 par la Cambridge Instrument Company. Le microscope électronique à balayage (Scanning electron microscope) opère sous un vide élevé ; l’échantillon à examiner est balayé de manière séquentielle, ligne par ligne, par un mince faisceau d’électrons primaires ; leur interaction avec l’objet donne naissance à l’émission de différents types d’électrons parmi lesquels des électrons secondaires et des électrons rétrodiffusés à partir desquels se construit une image des contours de l’échantillon, en nuances de gris, sur l’écran de visualisation d’un moniteur. On obtient des images, à haute résolution et à grande profondeur de champ ; le pouvoir séparateur des microscopes récents est inférieur à 5 nm. La microscopie électronique à balayage fournit des informations sur la topographie, et même la composition chimique des échantillons. Le traitement des données permet de reconstituer des images tridimensionnelles cellules, d’organites subcellulaires, de bactéries, virus et micro-organismes. On a également utilisé la microscopie électronique à balayage pour étudier des tissus et des organes.

Références : Zworykin VA, Hillier J, Snyder RL A scanning electron microscope (1942)
McMullen D Investigations relating to the design of electron microscopes (1952)
Everhart TE Contrast formation in the scanning electron microscope (1958)
Everhart TE, Wells OC, Oatley CW Factors affecting contrast and resolution in the scanning electron microscope (1959)
Everhart TE, Thornley RFM Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents (1960)
Haddad G, Bellali S, Takakura T, Fontanini A, Ominami Y, Bou Khalil J, Raoult D Scanning Electron Microscope: A New Potential Tool to Replace Gram Staining for Microbe Identification in Blood Cultures (2021)

Microscope à fluorescence (en épifluorescence)

Le phénomène de fluorescence est connu depuis le XVII^e siècle et le premier microscope à fluorescence a été construit au début du XX^e (1911-1913) par les physiciens Otto Heimstaedt et Heinrich Lehmann. Il observèrent la fluorescence émise par des bactéries et des tissus animaux et végétaux. Le principe sur lequel est basé le microscope à fluorescence est simple : lorsqu’une molécule absorbe un photon de longueur d’onde appropriée, elle passe en un temps très bref (de l’ordre du millionième de nanoseconde, 10^-15 seconde) de l’état électronique fondamental à un « état excité » hautement instable ; elle retombe à l’état fondamental en marquant préalablement un arrêt à un autre état excité, pendant un temps de l’ordre de la nanoseconde. Selon les cas, différents phénomènes accompagnent le retour à l’état fondamental. Dans le cas de la fluorescence, il y a émission rapide d’un photon d’énergie moins élevée (de longueur d’onde plus grande) que celle du photon absorbé. Ce décalage, appelé « déplacement de Stokes », a été décrit en 1852 par le physicien George G. Stokes (University of Cambridge). L’observation d’un échantillon fluorescent est d’autant plus facile que le déplacement de Stokes est plus élevé. En disposant d’un instrument approprié (un spectrofluorimètre, par exemple), il est possible de distinguer la lumière incidente de la lumière fluorescente émise. Lorsque la molécule est détectable, on la qualifie de fluorescente. Bien qu’il soit impossible de prédire à partir de la seule formule chimique si une molécule sera ou non fluorescente, on constate que les « fluorophores » ou « fluorochromes » contiennent souvent des cycles aromatiques avec doubles liaisons conjuguées. Très peu de molécules – et très peu de molécules biologiques – présentent une fluorescence primaire, c’est-à-dire sont spontanément fluorescentes.

Référence : Stokes GG On the change in refrangibility of light (1852)

Le succès de la microscopie à fluorescence est dû en partie au coût moins élevé de l’appareillage par comparaison à la microscopie électronique (sans avoir exactement la même utilité). Il suffit de disposer d’un microscope optique équipé d’un dispositif sélectionnant les longueurs d’onde des lumières incidente et réémise. La limite de résolution des premiers instruments était faible : environ 200 nm. Les images manquaient de netteté et de résolution : les coupes de tissus ayant une épaisseur finie, un point fluorescent est entouré d’autres points fluorescents et les images étaient brouillées par une fluorescence diffuse. Il fallut plus d’un demi-siècle aux ingénieurs et techniciens pour parvenir à éliminer la fluorescence diffuse par l’addition de filtres qui ne sélectionnent que la lumière émise.

En 1953, Marvin Mirsky (Massachusetts Institute of Technology) eut l’idée de coupler microscopie à fluorescence et technique confocale. Dans le microscope confocal à fluorescence (Laser Confocal Microcospe), commercialisé à partir de 1955, le spécimen est illuminé par un rayonnement laser monochromatique ; lumière incidente et lumière d’émission sont « filtrés » par un orifice (pinhole) de très faible diamètre. L’élimination de la lumière parasite diffusée est assurée par le choix d’orifices de différents diamètres et par le balayage latéral de zones ponctuelles successives (Laser Scanning Confocal Microscopy). Le faisceau laser illumine uniquement les fluorophores situés sur le trajet optique, découpant ainsi l’échantillon en fines tranches virtuelles. De plus, la lumière émise par les fluorophores est captée par un miroir dichroïque qui élimine les longueurs d’onde indésirables. La suppression du « bruit de fond » augmente la netteté des images. La lumière émise par le fluorophore excité par le rayon laser est captée par un tube photomultiplicateur ou une caméra. On obtient des images tridimensionnelles avec une bonne résolution. On peut suivre en temps réel les variations de concentration des ions (Ca²⁺) au sein des cellules, en employant des sondes fluorescentes qui changent de couleur ou d’intensité en fonction de la concentration ionique. En fonction de l’équipement d’imagerie de fluorescence du microscope confocal, on a pu observer non seulement des échantillons biologiques fixés et marqués par des fluorophores, mais aussi la dynamique des compartiments membranaires ou des macromolécules biologiques au sein des cellules.

Comme je l’ai dit plus haut, les constituants cellulaires ne sont pas spontanément fluorescents (fluorescence primaire) à quelques exceptions près : la chlorophylle, présente dans les chloroplastes des cellules végétales, émet une fluorescence rouge. Au début des années 1960, Osamu Shimomura (Princeton University) isola du système luminescent des cellules de méduse Aequoria victoria une photoprotéine capable d’émettre de la lumière en présence de traces de Ca²⁺ ; baptisée « aequorine », la protéine verte fluorescente (Green Fluorescent Protein) offre un moyen d’étudier le Ca²⁺ intracellulaire. En 1994, Martin Chalfie (Columbia University) montra que cette protéine fluorescente peut être exprimée dans les cellules procaryotes (Escherichia Coli) et eucaryotes (Caenorhabditis elegans) ouvrant ainsi la voie à une utilisation en biologie. Roger Tsien (Howard Hughes Medical Institute, University of California, San Diego) construisit par ingénierie génétique des protéines modifiées émettant, après excitation, une lumière jaune, bleue ou violette, ce qui élargit le spectre de longueurs d’onde d’émission utilisables. Les protéines fluorescentes sont généralement fusionnées par couplage à une protéine cellulaire dont on veut établir la localisation ou suivre les déplacements au sein de la cellule. On peut aussi obtenir des souris transgéniques dont les cellules synthétisent la protéine verte fluorescente. L’emploi sous toutes leurs formes des protéines fluorescentes est à l’origine du développement de l’imagerie moléculaire (imagerie de fluorescence) ; cette discipline, à la croisée de la biologie moléculaire et de la biologie cellulaire, offre une approche non-invasive : la protéine dont on veut observer le comportement est produite par les cellules elles-mêmes. Son émergence a été grandement facilitée par des progrès technologiques (i) les systèmes de détection (capteur photographique avec dispositif à transfert de charge : Charge-Coupled Device Camera) ; le rayonnement émis par l’objet fluorescent est transformé en signal électrique qui est à son tour transformé en image ; (ii) la tomographie (reconstitution tridimensionnelle d’un objet analysé tranche par tranche) ; (iii) le traitement informatique des images. C’est le moyen le plus élégant que l’on ait trouvé pour observer in vivo le fonctionnement de la cellule. Shimomura, Tsien et Chalfie reçurent le prix Nobel de chimie en 2008.

Références : Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression (1994)
Heim R, Tsien RY Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer (1996)
Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea (1962)
Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y Further data on the bioluminescent protein, aequorin (1963)
Shimomura O Luminescence of aequorin is triggered by the binding of two calcium ions (1995)

La microscopie à fluorescence fait un large usage de fluorochromes issus de la synthèse chimique (fluorescence secondaire). L’industrie en a produit une vaste gamme, excitables à différentes longueurs d’onde. On les utilise après couplage, généralement à un anticorps dressé contre un constituant cellulaire. Une exception : le diamidino phénylindole (DAPI) est directement utilisable ; il se lie à l’ADN bicaténaire, marquant ainsi le noyau cellulaire qui émet une fluorescence bleue. Le fura-2 (acide amino-polycarboxylique) fixe spécifiquement les ions Ca²⁺ présents dans certains compartiments cellulaires en émettant une fluorescence variant du vert au jaune. L’un des fluorochromes les plus anciennement utilisés est la fluorescéine : stimulée par une lumière incidente bleue (longueur d’onde : 450-490 nanomètres), elle émet une fluorescence verte (longueur d’onde de la lumière d’émission : 520-560 nanomètres). La rhodamine B émet une fluorescence rouge après excitation par une lumière jaune vert. En 1982, Roger Tsien a synthétisé un dérivé de la fluorescéine, le BCECF et son ester BCECF-AM capable de franchir la barrière membranaire entourant les cellules. Le BCECF est utilisé sans couplage pour mesurer le pH intracellulaire ou la concentration en ion K⁺. Le SNARF-1, un autre réactif employé pour la mesure du pH intracellulaire, réagit à la concentration en ions H⁺.

Pour le couplage des fluorochromes, les anticorps monoclonaux ont avantageusement remplacé les anticorps polyclonaux des débuts. Ces derniers reconnaissent plusieurs déterminants de l’antigène ; les anticorps monoclonaux sont spécifiques d’un seul déterminant. Les anticorps plolyclonaux sont obtenus par une série d’injections d’un antigène (une protéine) à un lapin. Le sérum de lapin recueilli constitue la source d’anticorps. La production d’un anticorps monoclonal commence de la même façon par l’injection d’un antigène à des animaux de laboratoires (le plus souvent des souris). Après prélèvement de la rate, les cellules sont libérées, triées et testées ; celles qui produisent et secrètent l’anticorps (plasmocytes) sont sélectionnées. Les plasmocytes sont « immortalisés » en les fusionnant avec des cellules de myélome qui ont la capacité de se multiplier indéfiniment aussi longtemps que le milieu de culture est renouvelé. Cette technique, dite des hybridomes, fut mise au point à la fin des années 1970 par César Milstein (Department of Biochemistry, University of Cambridge) et un étudiant post-doctoral, Georges J.F. Köhler. Elle permet de produire de grandes quantités d’anticorps monoclonaux (une révolution en immunologie). César Milstein, Georges Köhler et l’immunologiste Niels K. Jerne partagèrent en 1984 le prix Nobel de physiologie ou médecine. En pratique, l’anticorps monoclonal couplé à un marqueur fluorescent n’est pas utilisé directement. Pour avoir des signaux d’intensité suffisante et obtenir une sensibilité élevée on laisse l’anticorps monoclonal réagir avec la cible puis on ajoute un anticorps secondaire dirigé contre l’anticorps monoclonal et lié à un marqueur fluorescent. Dans certains cas, on utilise le couplage à un enzyme (immunocytochimie indirecte).

Microscopie à super-résolution

Il semblerait que pour un certain nombre de physiciens dépasser le mur de la diffraction qui limite la résolution spatiale du microscope optique ait été perçu comme un défi. C’est pour relever ce défi et après de longues années de tâtonnements, qu’ont été conçus les systèmes optiques à super-résolution. Un moyen de voir des objets beaucoup plus petits que la valeur d’une longueur d’onde de la radiation incidente est de réduire cette longueur d’onde. Le premier à franchir la « barrière d’Abbe » fut Walter Lukosz (Institut A für Physik, Technische Hochschule, Braunschweig) ; il a obtenu un modeste gain de résolution spatiale de l’ordre de deux en réduisant la gamme de fréquences de la lumière transmise – la bande passante spatiale – avec des filtres complémentaires (réseaux linéaires ou croisés) ; le champ de l’objet – la portion de la surface de l’objet que l’œil peut observer – a été réduit. Les efforts d’Eric A. Ash et de George Nicholls (University College, London) pour aller plus loin dans cette voie se sont heurtés à la formation d’une onde lumineuse évanescente. Une image agrandie de l’objet éclairé par une lumière évanescente de faible longueur d’onde, était produite par le procédé holographique de H. Nassenstein (Abteilung für Angewandte Physik der Farbenfabriken Bayer AG, Leverkusen).

Références : Lukosz W Optical systems with resolving powers exceeding the classical limit (1966)
Bachl A, Lukosz W Experiments on superresolution imaging of a reduced object field (1967)
Nassenstein H Holography with surface waves (`Subwaves’) (1970)
Ash EA, Nicholls G Super-resolution aperture scanning microscope (1972)

A ce stade, un petit rappel s’impose. En 1835, George B. Airy avait montré, qu’à cause de la diffraction (découverte dans les années 1820), l’image d’une molécule lumineuse n’est pas un point mais une tache. Pour un système optique, la limite de séparation de deux objets ponctuels est définie par le critère de Rayleigh, du nom du physicien John W.S. Rayleigh (The University of Cambridge, prix Nobel de physique 1904) :

θ = 1,22 λ/D

où θ est l’angle minimal entre deux objets ponctuels qu’un instrument optique peut séparer, λ, la longueur d’onde de la lumière et D, le diamètre de l’ouverture de l’instrument. Autrement dit, la résolution d’un microscope est inversement proportionnelle à la longueur d’onde de la lumière incidente (Ernst C. Abbe, 1873).

Référence : Airy GB On the Diffraction of an Object-glass with Circular Aperture (1835)

En 1984, Mike Isaacson et Aaron Lewis (Cornell University) diminuèrent d’une fraction la longueur d’onde de la lumière incidente en l’obligeant à traverser un orifice de très faible diamètre (30 nm). Ils construisirent un microscope optique équipé de ce dispositif. Sans faisceau d’électrons et sanslentilles, le microscope optique en champ proche (Near-field scanning optical microscope) d’Isaacson et Lewis atteignait la même résolution qu’un microscope électronique.

Référence : Lewis A, Isaacson M, Harootunian A, Muray A Development of a 500Å spatial resolution light microscope (1984)

Une contribution importante au développement de la microscopie à super-résolution a été apportée par la découverte des molécules fluorescentes photoactivables ; parmi celles-ci les plus étudiées sont les différentes espèces de protéine verte fluorescente photo-activable (Photoactivatable Green Fluorescent Protein). Lorsqu’elles sont éclairées par une lumière d’une longueur d’onde donnée, ces molécules passent de l’état fondamental à un état activé fluorescent ; elles peuvent être désactivées, ou excitées à un état différent, par une lumière d’une autre longueur d’onde ; en d’autres termes, on peut éteindre ou modifier leur fluorescence (molécules fluorescentes photo-convertibles) par un effet d’interrupteur ON/OFF, spécifique de chaque protéine ; on peut ainsi sélectionner des molécules individuelles au sein d’un mélange. En 2006, Samuel T. Hess, Thanu P.K. Girirajan et Michael D. Mason (University of Maine College of Liberal Arts and Sciences, Orono) mirent au point une technique d’imagerie en super-résolution : la microscopie par photoactivation, localisation et fluorescence (Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy). La distribution spatiale précise des molécules vertes fluorescentes photoactivables est établie en activant de manière aléatoire, à un moment donné, un petit nombre d’entre elles avec le faisceau à faible intensité d’un laser à haute fréquence. La fluorescence est enregistrée par un capteur CCD (Charge Coupled Device) ; on nettoie le champ en éteignant de manière réversible les fluorophores ou par photoblanchiment (photobleaching). L’image finale, à l’échelle du nanomètre, est construite à l’aide d’algorithmes informatiques à partir de tous les enregistrements de la distribution spatiale des biomolécules.

Référence : Hess TS, Girirajan TPK, Mason MD Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy (2006)

Dans la microscopie à émission déplétion stimulée STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), l’objet est stimulé par un laser d’excitation ; les fluorophores situés en périphérie du point d’excitation sont désactivés par émission stimulée à l’aide d’un laser en couronne (donut). La taille effective du point focal est ainsi réduite et la résolution spatiale, augmentée. Stefan W. Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Heidelberg), le promoteur de la microscopie STED, a partagé le prix Nobel de chimie 2014 avec Eric Betzig et William Moerner.

Référence : Hell SW Far-Field Optical Nanoscopy (2007)

Les techniques de microscopie de localisation de molécules individuelles SMLM (Single Molecule Localization Microscopy) sont toutes basées sur le même principe : localiser des molécules uniques pour créer des images à très haute résolution, à l’échelle nanométrique, générées par traitement informatique. Les molécules fluorescentes sont activées de manière aléatoire, séparément dans le temps ; à un instant donné, seul un petit nombre de molécules sont allumées ; le centre de la tache de diffraction de chaque molécule est localisé avec précision. A partir des données d’une série d’enregistrements, on procède à une reconstruction algorithmique d’une image de super-résolution. La dénomination « microscopie de localisation de molécules individuelles » fait référence à deux techniques : la microscopie PALM et la microscopie STORM.

La microscopie par localisation photoactivée PALM (Photoactivated Localization Microscopy) a été inventée par le physicien Eric Betzig (Molecular and Cell Biology Department, The University of California, Berkeley). C’est une microscopie en fluorescence dite en champ large, applicable aux objets de faible épaisseur et induisant peu de blanchiment. Elle est basée sur le principe énoncé ci-dessus : stimuler brièvement la fluorescence de biomolécules individuelles ; celles-ci émettant de la lumière une par une, il est possible de séparer les photons venant de chaque émetteur. La résolution obtenue est de l’ordre de 20 nm. Eric Betzig a reçu le prix Nobel de chimie 2014.

Références : Lewis A, Isaacson M, Harootunian A, Muray A Development of a 500Å spatial resolution light microscope (1984)
Betzig E, Harootunian A, Lewis A, Isaacson M Near-field diffraction by a slit: implications for superresolution microscopy (1986)
Betzig E, Lewis A, Harootunian A, Isaacson M, Kratschmer E Near-field scanning optical microscopy: development and biophysical applications (1986)
Betzig E, Trautman JK Near-Field Optics : Microscopy, Spectroscopy, and Surface Modification Beyond the Diffraction Limit (1992)

En 2006, Michael J. Rust, Mark Bates et Xiaowei Zhuang (Xiamen University Malaysia Campus) ont inventé la microscopie de reconstruction stochastique STORM (Stochastic Optical reconstruction Microscopy). L’image est reconstruite en combinant les informations de localisation de haute précision de fluorophores individuels, en plusieurs couleurs et en trois dimensions (en utilisant une optique 3D-STORM appropriée). Un petit nombre de fluorophores individuels sont activés ou désactivés de manière aléatoire (stochastique), à des longueurs d’onde données ; la séparation temporelle de ces molécules est obtenue en utilisant une lumière de très faible intensité. Le clignotement ainsi produit est enregistré de molécule à molécule. Lorsque tous les points ont été activés, la combinaison informatique des coordonnées moléculaires en trois dimensions permet d’obtenir des images 3D de super-résolution.

Références : Rust, MJ, Bates M, Zhuang X Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) (2006)
B Huang B, W Wang W, M Bates M, X Zhuang X Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (2008)

Le pionnier de la microscopie à illumination structurée SIM (Structured Illumination Microscopy) est Mats G.L. Gustafsson (Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco). Dans cette technique, au lieu d’être éclairé par une lumière uniforme, l’échantillon est illuminé séquentiellement par un réseau de franges ou de grilles lumineuses, orientées et déphasées de différentes manières. L’interaction entre le motif lumineux structuré et les structures fines de l’échantillon génère des franges de Moiré de basse fréquence qui contiennent des informations de haute fréquence spatiale. Plusieurs images, avec des motifs décalés et tournés, sont capturées et traitées mathématiquement pour reconstruire une image de super-résolution. La microscopie à illumination structurée offre comme avantages une amélioration de la résolution (100 nm) deux fois supérieure à la limite de diffraction conventionnelle et la possibilité d’obtenir des images dynamiques en couleurs et en trois dimensions. La microscopie SIM, opérant avec un éclairement relativement faible, les puissances laser utilisées sont notablement moins élevées que dans les microscopies PALM, STORM ou STED ; il en résulte une réduction de la phototoxicité permettant l’observation prolongée, sur cellules vivantes, de processus biologiques dynamiques comme le transport vésiculaire du reticulum endopasmique à la membrane plasmique. On utilise les mêmes fluorophores, colorants fluorescents ou protéines fluorescentes qu’en microscopie à fluorescence conventionnelle. En employant simultanément plusieurs marqueurs colorés, on peut obtenir une imagerie 4D (incluant le temps) en couleur des différents organites subcellulaires, leurs interactions et même leur composition (Matthew B. Stone et coll., 2017). Enfin, la microscopie SIM est une technique à champ large (utilisant toute la surface de la caméra) dont la mise en œuvre est plus rapide que les méthodes microscopiques point par point.

Références : Gustafsson MGL, Hristova Y, Moerner WE Fluorescence microscopy with superresolution lateral tomography (1999)
Gustafsson MGL Surpassing the lateral resolution limit by wide-field fluorescence microscopy using structured illumination (2000)
Stone MB, Shelby SA, Veath SL Super-Resolution Microscopy: Shedding Light on the Cellular Plasma Membrane (2017)

Dans la microscopie PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography), la liaison des fluorophores aux organites subcellulaires ou aux structures biologiques que l’on veut étudier n’est pas permanente ; les fluorophores sont liés de manière aléatoire (stochastique) et réversible, de sorte qu’à un instant donné, seule une proportion limitée des sondes fluorescentes est liée à la cible ; cette association – dissociation transitoire des fluorophores est à la base de la microscopie PAINT. Leur localisation individuelle est rendue possible par la commutation ON/OFF et OFF/ON dans le temps, de leur fluorescence. La localisation précise du centre de gravité de la tâche de diffusion est confiée à des algorithmes de traitement d’image. L’image finale de super-résolution est construite à partir des données de milliers de positions des sondes fluorescentes. Dans sa version DNA-PAINT, la liaison réversible aux structures subcellulaires est assurée par de courts brins d’ADN complémentaires : un brin d’ancrage (docking strand) fixé par un anticorps à la structure, et un brin imageur (imager strand) portant le fluorophore ; la liaison entre les brin complémentaires d’ancrage et imageur est temporaire ; sa durée dépend de la séquence des brin d’ADN ou de leur longueur. En ajustant ces paramètres, on peut contrôler la cinétique du clignotement des points fluorescents.

La microscopie Paint présente un certain nombre d’avantages par rapport aux microscopies STORM et PALM, auxquelles elle s’apparente (PAINT fait aussi partie des méthodes de microscopie de localisation de molécules individuelles). La résolution (jusqu’à 10 nm) est meilleure que celles obtenues avecSTORM et PALM. Le photoblanchiment du fluorophore est d’autant plus facile que le brin imageur change constamment. En remplaçant la solution de brins imageurs (sans changer leur séquence), on peut cibler une nouvelle structure ou une autre biomolécule ; le multiplexage, qui est compliqué avec PALM et très compliqué avec STORM, ne l’est pas avec DNA-PAINT (images multi-couleurs).

Référence : Nieves DJ, Gaus K, Baker MAB DNA-Based Super-Resolution Microscopy: DNA-PAINT (2018)

Il n’est pas exagéré de dire que, dans le domaine de la Biologie cellulaire, l’introduction de la microscopie à super-résolution a été à l’origine d’une révolution en donnant accès à l’observation à l’échelle nanométrique de structures subcellulaires complexes. Je vais prendre comme premier exemple l’une des structures moléculaires la plus volumineuse et la plus sophistiquée de la cellule eucaryote : le complexe du pore nucléaire. Ces orifices, qui traversent la double membrane de l’enveloppe nucléaire, constituent les points de passage du nucléopasme au cytoplasme (pour les ARNm, ARNr) et du cytoplasme au nucléopasme (pour les histones, polymérases). Pour qu’une macromolécules puisse transiter par le pore nucléaire, elle doit porter un signal de localisation spécifique (Nuclear Localization Signal ou Nuclear Exportation Signal). C’est en ce sens que l’on peut parler de sophistication : le canal doit être à la fois ouvert au transport de masse et extrêmement sélectif. Sur le plan structurel, le pore nucléaire est un cylindre constitué de trois anneaux concentriques, d’un panier nucléaire et de filaments cytosoliques, le tout constitué par l’assemblage de plusieurs centaines de protéines (nucléoporines), pour un poids moléculaire d’environ 125.000 kDa. Je donne ci-dessous quelques références d’articles portant sur l’étude du pore nucléaire.

Références : Szymborska A, de Marco A, Daigle N, Cordes VC, Briggs JAG, Ellenberg J Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging (2013)
Thevathasan JV, Kahnwald M, Cieslinski K, Hoess P, Peneti SK, Reitberger M Heid D, Kasuba KC, Hoerner SJ, Li Y, Wu YL, Mund M, Matti U, Pereira PM, Henriques R, Nijmeijer B, Kueblbeck M, Sabinina VJ, Ellenberg J, Ries J Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy (2019)
Sabinina VJ, Hossain MJ, Hériché JK, Hoess P, Nijmeijer B, Mosalaganti S, Kueblbeck M, Callegari A, Szymborska A, Beck M, Ries J, Ellenberg J Three-dimensional superresolution fluorescence microscopy maps the variable molecular architecture of the nuclear pore complex (2021)
Vial A, Costa L, Dosset P, Rosso P, Boutières G, Faklaris O, Haschke H, Milhiet PE, Doucet CM Structure and mechanics of the human Nuclear Pore Complex basket using correlative AFM-Fluorescence Superresolution Microscopy (2023)
Ye X, Guan M, Guo Y, Liu X, Wang K, Chen T, Zhao S, Chen L Live-cell super-resolution imaging unconventional dynamics and assemblies of nuclear pore complexes (2023)

Comme second exemple, je prendrai les invaginations de la membrane mitochondriale interne connues sous le nom de crêtes mitochondriales. L’existence des cristae augmente notablement la surface de cette membrane. Loin d’être des structures statiques, elles subissent un remodelage constant en fonction de l’activité des complexes multimériques de la chaîne respiratoire (complexes I à IV) et de l’ATP synthase (complexe V). On avait, par diverses approches, déterminé l’ordre dans lequel sont disposés ces complexes sur la face de la membrane mitochondriale interne en contact avec la matrice ; la microscopie à super-résolution a permis l’observation directe de leur organisation spatiale à l’échelle nanométrique. On a aussi pu déterminer que la courbure des crêtes mitochondriales leur est imposée par les alignements réguliers des dimères d’ATP synthase. Enfin, on a pu montrer que les crêtes mitochondriales sont des structures dynamiques dont l’organisation tridimensionnelle est liée à leur fonction dans la cellule normale ou pathologique.

Références : Schmidt R, Wurm CA, Jakobs S, Engelhardt J, Egner A, Hell SW Mitochondrial cristae revealed with focused light (2009)
Dlasková A, Smékal V, Křen V, Hozák P 3D super-resolution microscopy reflects mitochondrial cristae alternations and mtDNA nucleoid size and distribution (2018)
Palmer CS, Lou J, Kouskousis B, Pandzic E, Anderson AJ, Kang Y, Hinde E, Stojanovski D Super-resolution microscopy reveals the arrangement of inner membrane protein complexes in mammalian mitochondria (2021)
Sant S, Yang H, Fogo Taguchi K, Elias BC, Krystofiak E, Qian AB, Brooks CR Quantitative Super-Resolution Microscopy Reveals Promoting Mitochondrial Interconnectivity Protects against AKI (2021)
Leisten ED, Woods AC, Wong YC Super resolution microscopy: Insights into mitochondria–lysosome crosstalk in health and disease (2023)
Ren W, Ge X, Li M, Sun J, Li S, Shan C, Gao B, Xi P Visualization of cristae and mtDNA dynamics and interactions with super-resolution microscopy(2023)

Articles de revue : Jakobs S, Wurm CA Super-resolution microscopy of mitochondria (2014)
Teixeira P, Galland R, Chevrollier A Super-resolution microscopies, technological breakthrough to decipher mitochondrial structure and dynamic (2024)

Comme domaines d’étude où l’emploi de la microscopie à super résolution a permis de substantiels progrès des connaissances, j’aurai encore pu citer les microfilaments d’actine et les microtubules du cytosquelette, les mouvements intracellulaires des vésicules de transport (les microscopies PALM, STORM, STED sont compatibles avec l’étude de cellules vivantes), les virus ou les terminaisons nerveuses (synapses).

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Ultracentrifugeuse

Isoler les organites de la cellule

«… the use of the microscope, alone or in conjunction with ingenious techniques of fixation, staining, or microdissection, has repeatedly failed in answering two of the major queries of modern cytology ; namely, what is the chemical nature of the diverse protoplasmic structures and what is the intracellular topography of biochemical function. »

Albert Claude

La citation en exergue résume parfaitement le problème auquel furent confrontés les biologistes au milieu du XX^e siècle. Les microscopistes avaient découvert un certain nombre d’organites (noyau, mitochondries, complexe de Golgi) mais avant leur séparation du contexte cellulaire et l’analyse de leur composition biochimique, leur fonction dans la cellule resta mystérieuse. La mise à la disposition des scientifiques d’un nouvel instrument allait ouvrir un nouveau champ d’exploration de la cellule. Des particules soumises à une force se déplacent dans la direction de cette force à une vitesse qui, en première approximation, est proportionnelle à leur taille (à leur volume) : les grosses particules se déplacent plus vite que les petites. C’est sur ce principe qu’est basée la séparation des organites cellulaires ; il suffit de leur appliquer une force centrifuge dans un espace restreint. Les premières centrifugeuses étaient actionnées à la main. Une centrifugeuse de ce type fut utilisée par Friedrich Miescher en 1869 pour isoler les noyaux. Des centrifugeuses dites « préparatives », animées par des moteurs et non plus à la main, furent en usage à la fin des années 1920.

L’apparition de centrifugeuses tournant à haute vitesse, les ultracentrifugeuses, date des années 1930. Le physicien Emile J.C. Henriot (Université libre de Bruxelles) et le chimiste Theodor H.E. Svedberg (Uppsala Universitet, prix Nobel de chimie 1926), indépendamment l’un de l’autre, construisirent des ultracentrifugeuses dont la partie mobile (rotor) tournait à très grande vitesse. En 1925, le rotor horizontal de la centrifugeuse d’Emile Henriot et Eugène Huguenard (Laboratoire d’aviation de l’Ecole des hautes études, Bruxelles), mû par un jet d’air comprimé, pouvait tourner à 200.000 tours par minute et développer une force centrifuge de 400.000 g. Les champs centrifuges ainsi générés étaient suffisamment élevés pour déplacer des particules de la taille des protéines et des acides nucléiques. La firme Bardet de Paris construisit plusieurs exemplaires de la centrifugeuse d’Henriot-Huguenard, avec le soutien financier du Fonds National de la Recherche Scientifique belge.

Svedberg apporta une importante contribution dans le domaine des ultracentrifugeuses en abordant un faux problème. A la fin du XIX^e siècle et au début du XX^e, circulait, surtout parmi les chimistes, la « théorie des colloïdes », encore appelée « théorie des agrégats » ou « théorie colloïdale du vivant ». Selon cette théorie, les substances se divisaient en « cristalloïdes » et « colloïdes ». Ces derniers étaient de masse élevée et non-dialysables car composés de « micelles » dont la cohésion était assurée par des liaisons différentes des liaisons covalentes, mais dont on ne connaissait pas la nature. L’état colloïdal était considéré comme une caractéristique de la matière vivante, en particulier du protoplasme. Toujours selon cette théorie, la masse d’une molécule ne pouvait pas dépasser une valeur d’environ 5.000. La formation d’entités de plus grande taille résultait de l’association d’unités de taille égale ou inférieure à 5.000. Des ouvrages exposant ces conceptions furent publiés, par Wladyslaw Kopaczewski et par Jacques E. Duclaux (l’Institut Pasteur, Paris).

Références : Svedberg T Studien zur Lehre von den kolloiden Lösungen (1908)
Svedberg T Die Methoden zur Herstellung kolloider Lösungen anorganischer Stoffe (1909)
Svedberg T Colloid Chemistry (1914)
Kopaczewski W Théorie et pratique des colloïdes en biologie et en médecine (1918)
Duclaux JE Les Colloïdes (1922)
Kopaczewski W Traité de biocolloïdologie (1930)

Pour soumettre la théorie colloïdale du vivant à l’épreuve expérimentale, Svedberg centrifugea à très haute vitesse une solution contenant des protéines dans une cellule en quartz sertie dans le rotor de son ultracentrifugeuse. La cellule était traversée par un rayon lumineux ce qui permettait de suivre en continu le déplacement des particules dans le champ centrifuge (les acides aminés des protéines absorbent le rayonnement ultraviolet). La migration des protéines était enregistrée. Pour interpréter les résultats, Svedberg utilisa une équation permettant de calculer la masse d’une particule à partir de sa vitesse de migration (il avait préalablement effectué une étude théorique du déplacement d’une particule dans un champ centrifuge). Svedberg reçut le prix Nobel de chimie 1926 ; son nom a été donné à une unité de temps : le Svedberg (S = 10^-13sec), utilisé pour exprimer le coefficient de sédimentation des macromolécules (ARN 5S) et des composants subcellulaires (ribosome 30S).

Références : Svedberg T Die Existenz der Moleküle (1912)
Svedberg T, Pedersen K The Ultracentrifuge (1940)

Contrairement à ce que prédisait la théorie des colloïdes la masse moléculaire des protéines pouvait dépasser 5000. Le concept de « cristalloïde » fut aussi durement ébranlé que celui de colloïde lorsque James B. Sumner (prix Nobel de chimie en 1946) cristallisa l’uréase, en 1926. De 1930 à 1935, ce fut le tour des enzymes protéolytiques, parmi lesquels la pepsine. C’était le chant du cygne de la Théorie colloïdale du Vivant au profit de la notion de « macromolécule », selon le terme introduit en 1922 par le chimiste Hermann Staudinger (École polytechnique fédérale, Zurich).

Références : Sumner JB The Isolation and Crystallization of the Enzyme Urease: Preliminary Paper (1926)
Northrop JH Crystalline Pepsin (1929)
Staudinger H Uber Polymerisation (1920)

Dans les années 1930, le physicien Jesse W. Beams (University of Virginia) construisit une ultracentrifugeuse magnétique atteignant des vitesses de rotation supérieures à l’ultracentrifugeuse de Svedberg. Johannes H. Bauer et Edward G. Pickels, un élève de Beams, construisirent une ultracentrifugeuse « analytique » mue par la pression d’un jet d’air et opérant sous vide, destinée à la détermination des coefficient de sédimentation des protéines. Le rotor en aluminium, de petite taille et de forme ovale, était doté d’une cellule transparente. La vitesse de rotation atteignait 60.000 rpm, correspondant à une force centrifuge de 260.000 g. Les ultracentrifugeuses analytiques ne peuvent traiter que de faibles volumes ; la nécessité de construires des centrifugeuses « préparatives » se fit sentir sous la pression des virologistes, désireux d’obtenir des quantités suffisantes de virus (c’était l’époque de la préparation du vaccin contre la polyomyélite). Beams (University of Virginia) et Pickels conçurent une telle centrifugeuse en reprenant le concept du rotor horizontal d’Henriot, équipé de tubes de grand volume ; ils le fixèrent sur un axe vertical dans une enceinte sous vide pour éviter l’échauffement du rotor. En 1943, Pickels commença la construction d’une centrifugeuse préparative dans l’atelier du Rockefeller Institute for Medical Research, avec le soutien financier de la Rockefeller Foundation. L’enceinte contenant le rotor était réfrigérée (le matériel biologique s’altère rapidement à température ordinaire) et maintenue sous vide. Pour la commercialiser, Pickels créa en 1949 la firme Spinco (SPecialized INstruments COrporation). La mise sur le marché de la centrifugeuse Spinco ne suscita qu’un enthousiasme limité. L’entreprise frôla la faillite et fut rachetée en 1954 par Beckman Instruments.

Références : Beams JW, Haynes FB The Separation of Isotopes by Centrifuging (1936)
Beams JW Production and Use of High Centrifugal Fields (1954)
Bauer JH, Pickels EG An Improved Air-Driven Type of Ultracentrifuge for Molecular Sedimentation (1937)

Il fallut des années aux biologistes pour prendre conscience des possibilités offertes par l’ultracentrifugation préparative. Le déclic se produisit après la publication, en 1946, de l’article d’Albert Claude dans lequel il jetait les bases du fractionnement subcellulaire quantitatif. La méthode fut améliorée par ses élèves du Rockefeller Institute for Medical Research : Georges Hogeboom, Walter Schneider et George Palade. La méthode peut être résumée brièvement ainsi : un homogénat de tissus en suspension dans une solution de saccharose isotonique est soumis à une série de (3 ou 4) centrifugations différentielles à vitesse de rotation du rotor chaque fois plus élevée. Les plus gros organites, les noyaux, sédimentent à basse vitesse ; les plus petits organites, les microsomes, sédimentent lors de la dernière centrifugation à haute vitesse. Dans les années 1930, se développa une technique de séparation des organites basée non plus sur leur volume, mais sur leur densité d’équilibre dans un milieu de composition déterminée. Les premières expériences portèrent sur la séparation de mitochondries dans des solutions de solvants organiques. Par la suite, l’on utilisa des solutés comme le saccharose pour les organites subcellulaires ou le chlorure de césium pour les ribonucléoprotéines.

La commercialisation de rotors à godets basculants en 1953 favorisa la généralisation de l’usage de la centrifugation en gradient de densité. La construction de gradients linéaires de densité, une condition sine qua non du caractère analytique de la méthode, nécessita la construction de machines appropriées. Henri Beaufay et Jacques Berthet (Laboratoire de chimie physiologique, Université catholique de Louvain) construisirent une machine à cames délivrant un gradient de densité linéaire en fonction du volume et un sectionneur de tubes permettant le recueil des fractions. Dans les laboratoires ne possédant pas de machine à gradient (ou hésitant à les utiliser), on pratiqua la superposition de couches de densités décroissantes. Après diffusion du soluté pendant un temps plus ou moins long, un pseudo-gradient « en marches d’escalier » s’établit. Ce procédé est souvent générateur d’artefacts de séparation (voir Chapitre Small Granules).

Références : Kopaczewski W Théorie et pratique des colloïdes en biologie et en médecine (1923)
Claude A. Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation (1946)