Noyau

Anthonie van Leeuwenhoek aurai-t-il découvert le noyau des cellules ? Dans une lettre envoyée en 1702 à la Royal Society de Londres, il mentionna la présence d’un point lumineux au centre des globules rouges de poissons [1]: « …a clear sort of light in the middle ». Vingt ans plus tôt, il avait déjà observé la présence de globules dans les cellules sanguines de morue et de saumon, mais, comme le fait remarquer Henry Harris dans son ouvrage « The Birth of the Cell » : « Leeuwenhoek saw globules everywhere. » Quoiqu’il en soit, la découverte du noyau est attribuée à Robert Brown, un botaniste ayant acquis une certaine notoriété en participant à l’exploration des côtes de l’Australie ; à son retour en Angleterre il avait publié un travail monumental sur la flore de ce continent. Depuis, il poursuivait des recherches sur les végétaux, tout en cumulant les fonctions de Curator (conservateur) au British Museum pour la botanique et de bibliothécaire de la Linnaean Society, dont il deviendra le président. Il découvrit, en 1827, l’agitation qui affecte les particules en suspension dans un liquide, le « mouvement brownien ». En 1829, il assista à un exposé que Giovanni Baptista Amici, astronome à l’Université de Modène, fit devant les membres de la Royal Society de Londres pour vanter la qualité de ses microscopes. Cet exposé eut une influence décisive sur l’orientation des travaux de Brown ; en 1831, il découvrit un organite sphérique au centre de cellules végétales observées avec un microscope fabriqué à Londres par Banks & Sons et Dollon. Le noyau des cellules animales fut observé quelques années plus tard.

Le noyau est le plus volumineux des organites subcellulaires ; d’un diamètre de 5 micromètres en moyenne, il est généralement sphérique, bien que dans certaines cellules il soit ovoïde ou plurilobé. Il disparaît au début de la division cellulaire et se reforme à la fin. De nouvelles méthodes de coloration des cellules (et des noyaux) apparurent vers le milieu du XIXe siècle, après la synthèse de dérivés de l’aniline ; étant basophiles, ils se fixent sur les acides nucléiques et colorent fortement la chromatine nucléaire. Au microscope optique, on peut observer l’enveloppe nucléaire et le nucléoplasme, composé d’euchromatine finement réticulée et d’hétérochromatine formant des amas foncés aux contours irréguliers. Ces différences morphologiques traduisent des différences fonctionnelles : l’euchromatine est la partie active du génome, celle dont les gènes sont transcrits en ARN ; l’hétérochromatine est la portion du génome au repos. Au microscope électronique, l’enveloppe nucléaire révèle sa nature de double membrane : une membrane externe en continuité avec le réticulum endoplasmique et une membrane interne (« lamina ») en contact avec le nucléoplasme. L’enveloppe est percée de pores nucléaires.

Cellule de tumeur ascitique
Cellule de tumeur ascitique observée au microscope à contraste de phase. Le noyau est entouré par le cytoplasme, contenant diverses inclusions. La cellule est bordée par la membrane plasmique. La microscopie à contraste de phase permet l’examen de tissus non fixés et non colorés.

 

L’examen au microscopie optique a aussi révélé la présence dans le noyau de multiples inclusions ; la plus volumineuse est le nucléole, une masse hétérogène aux contours irréguliers qui fixe fortement les colorants. Les corps de Cajal furent décrits en 1903 par l’histologiste Santiago Ramon y Cajal dans le noyaux des neurones ; ce sont de petites masses arrondies d’un diamètre compris entre 200 et 600 nanomètres ; elles furent renommés « coiled bodies » après que l’examen au microscope électronique eut révélé la présence de fils enroulés. Ils y a généralement un à trois corps de Cajal par noyau ; ils renferment une protéine spécifique : la coïline-p80 et seraient le lieu d’assemblage de petites ribonucléoprotéines (snRNP). Apprenti coiffeur, puis cordonnier et enfin médecin, Cajal partagea, en 1906, le prix Nobel de médecine ou physiologie avec Camilio Golgi pour ses travaux sur le système nerveux. Les PML Nuclear bodies sont des structures dynamiques existant en 10 à 20 exemplaires par noyau, dans les cellules de mammifères ; elles tirent leur nom de la ProMyelocytic Leukemia protein, qui joue un rôle dans le contrôle de certaines formes d’homéostasie cellulaire. Les PML Nuclear bodies seraient impliqués dans la leucémie aigüe promyélocytaire. Les Nuclear speckles (20 à 50 par noyau) sont des granules inter-chromatiniens riches en facteurs d’épissage des pré-ARNm (spliceosome) et regroupés en structures de forme irrégulières.

Noyau d’une cellule en interphase, observé au microscope électronique
Noyau d’une cellule en interphase, observé au microscope électronique.

 

Grace aux techniques d’hybridation in situ, couplées à la microscopie à fluorescence, les idées sur l’organisation du nucléoplasme ont évolué. Malgré l’absence de cloisonnement interne par des membranes, on s’est aperçu que les chromosomes ne sont pas répartis de manière aléatoire mais occupent des « territoires » définis : au centre du noyau, les chromosomes de petite taille et, à la périphérie, ceux de grande taille, au contact de la lamina à laquelle ils sont ancrés par des protéines, parmi lesquelles la protéine II (Lamin associated protein II) et le récepteur de la lamine B. Les territoires chromosomiques sont eux-mêmes divisés en sous-domaines, séparés les uns des autres par un réseau canaliculaire appelé domaine inter-chromosomique. Ce serait le site privilégié des Nuclear speckles intervenant à certaines étapes de la transcription, l’épissage et la maturation des ARNm ; les ARNr sont synthétisés dans le nucléole. Cette organisation compartimentée du noyau faciliterait l’expression rapide des gènes en réponse à la stimulation d’un récepteur de la surface des cellules.


 Nucléole

Felice Fontana mentionna, en 1781, l’existence d’une structure arrondie à l’intérieur du noyau. De nouvelles techniques de coloration ayant été mises au point, Wagner décrivit en 1835 l’organite que l’anatomiste William Bowman nomma « nucléole » en 1840. Le réactif de Feulgen, utilisé pour colorer la chromatine nucléaire, ne colore pas le nucléole. Par contre, il est visible au microscope à contraste de phase sur des cellules en culture non fixées, ce qui a permis à de nombreux observateurs de confirmer l’observation initiale d’Edouard Balbiani (en 1864) sur le caractère dynamique du nucléole et les mouvements qui se déroulent en son sein.

Le nucléole disparaît avec le noyau au moment de la mitose ; il n’y a pas de nucléole ou de structure équivalente chez les procaryotes. Le matériel de choix pour l’étude de sa structure et de sa physiologie est l’ovocyte, une cellule présente dans l’ovaire et qui se différencie en ovule ; dans le cas de la vésicule germinative des Amphibiens, l’ovocyte renferme plusieurs nucléoles ; ils sont particulièrement bien développés dans les ovocytes d’araignées utilisés par Balbiani pour ses travaux. A la fin du XIXe siècle et au début du XXe, l’on essaya l’approche histochimique : elle donna peu d’informations utiles. L’examen au microscope électronique fournit des données morphologiques : à la fin des années 1950, Françoise Haguenau, Charles Oberling et Wilhelm Bernhard (Institut de recherches sur le cancer, Villejuif) observèrent une structure en éponge, l’absence de membrane limitante et un mélange de fibrilles et de granules. Le nucléole comporte : (i) une zone formée de granules de 15 à 20 nanomètres de diamètre, plus ou moins dispersés ; (ii) un réticulum de fibrilles de 5 à 8 nanomètres de diamètre ; (iii) une matrice amorphe relativement perméable aux électrons ; (iv) des ramifications de chromatine.

Le nucléole isolé : une usine à ribonucléoprotéines

Des tentatives d’isolement, à partir de foie de rat ou d’ovocytes d’étoiles de mer, furent entreprises dans le laboratoire de Jean Brachet (Université libre de Bruxelles) par Walter Vincent. Brachet était un pionnier de l’étude de l’ARN ; il avait montré, en 1940, que la basophilie du nucléole et du cytoplasme disparaît après traitement par de la ribonucléase. Les résultats de Vincent confirmèrent la richesse en ARN du nucléole. En 1940, Torbjörn O. Caspersson et J. Schultz avaient fait la même constatation. Caspersson avait commencé sa thèse de doctorat en 1936 au Karolinska Institutet sur l’étude de la composition du noyau par spectroscopie dans l’ultraviolet ; il avait mis en évidence le pic d’absorption caractéristique des acides nucléiques dans le nucléole de noyaux isolés. Comme le nucléole ne réagit que faiblement à la réaction de Feulgen, ce pic devait correspondre à la présence d’ARN. Caspersson tira comme conclusion de ses travaux que le nucléole était le lieu de synthèse des ribonucléoprotéines (exact) et des protéines cytoplasmiques (faux). Le traitement par des enzymes permit de montrer que le matériel nucléolaire n’est pas réparti de manière uniforme : la ribonucléase affecte la partie granulaire tandis que la pepsine entraîne la digestion des autres parties.

Morphologie du nucléole
Morphologie du nucléole chez les eucaryotes supérieurs. Dépourvu de membrane limitante, il comporte trois compartiments : le composant fibrillaire dense (pars fibrosa), le centre fibrillaire (pars amorpha), contenant l’ARN polymérase I et les facteurs de transcription associés ; les gènes des ARNr seraient concentrés à la frontière entre ces deux zones, et le centre granulaire (pars granulosa), site d’assemblage des particules pré-ribosomiques. Chez les eucaryotes simples, le nucléole est formé d’un réseau fibrillaire et d’une région granulaire.

 

La fonction du nucléole resta mal connue jusque vers le milieu des années 1950. Parmi les hypothèses avancées, l’ARN nucléolaire serait le précurseur de l’ADN chromosomique ; il constituerait une étape intermédiaire entre l’ADN nucléaire et l’ARN ribosomial (ARNr) cytoplasmique. A l’appui de cette thèse, Margaret I.H. Chipchase et Max L. Birnstiel firent remarquer que les granulations nucléolaires ont la même taille que les ribosomes. L’utilisation d’anticorps monoclonaux portant un marqueur fluorescent ou radioactif, et des techniques de biologie moléculaire et de génétique permirent de démontrer que le nucléole produit les ribosomes dont la cellule a un constant besoin pour fabriquer ses protéines et assurer ainsi la croissance et la prolifération cellulaires. Il intervient dans trois processus : la synthèse et la maturation des ARNr ; l’assemblage des pré-ribosomes ; l’exportation des sous-unités (la grande et la petite) à l’extérieur du noyau vers le cytoplasme où, en présence d’ARNm, elles s’unissent pour former les ribosomes fonctionnels.

Dans le processus de synthèse et d’assemblage des ribosomes, la vitesse d’exécution est un impératif. Les gènes d’ADNr sont regroupés dans le génome de façon à accélérer au maximum leur transcription par l’ARN polymérase I. Le produit de transcription est une longue molécule de pré-ARNr 45S regroupant trois des quatre ARN entrant dans la composition du ribosome. La maturation du pré-ARNr 45S fait intervenir une armée de « petites mains » : méthyl transférases (les bases sont méthylées), isomérases, (les uridines sont transformées en pseudo-uridines), nucléases (le pré-ARNr 45S est découpé en ARNr-5,8S, ARNr-18S, ARNr-28S). La maturation est suivie d’une phase d’assemblage en pré-ribosomes associant ARNr et protéines ribosomiales (synthétisées dans le cytosol et importées via les pores nucléaires). Dans le cytoplasme, le ribosome qui s’associe à une molécule d’ARNm possède quatre molécules d’ARNr : trois molécules transcrites dans le nucléole (ARNr-5,8S, ARNr-18S, ARNr-28S) et un ARNr 5S transcrit dans le nucléoplasme par l’ARN polymérase III.La découverte du processus de maturation des ARNr a incité les biochimistes à rechercher des processus similaires pour les ARNm et ARNt.

Outre les pré-ribosomes, le nucléole est le site où sont de synthétisées (partiellement) deux autres ribonucléoprotéines essentielles au fonctionnement des cellules : la télomérase et la particule de reconnaissance du signal. La télomérase, découverte en 1985 par Elizabeth Blackburn et Carol Greider (University of California at San Francisco), est formée de l’association d’une protéine, la TElomerase Reverse Transcriptase (TERT) synthétisée dans le cytosol et d’un ARN de petite taille appelé TElomerase Rna Component (TERC). La télomérase est une ADN polymérase qui ajoute une séquence répétée de désoxyribonucléotides (télomère) à l’extrémité des chromosomes linéaires. Pour des raisons mécaniques, à chaque cycle de réplication par l’ADN polymérase II, se produit un raccourcissement de la longueur des chromosomes. La fonction de la télomérase est de maintenir la longueur initiale. L’ARN TERC sert de matrice à la polymérase en s’appariant aux séquences complémentaires des télomères. Le raccourcissement de la longueur des chromosomes provoquerait le vieillissement et la sénescence des cellules. L’importance de la découverte de Blackburn et Greider fut reconnue par l’attribution du prix Nobel de médecine et physiologie en 2009.

La particule de reconnaissance agit conjointement avec le ribosome pendant la synthèse protéique dans le cytosol. La cellule fabrique en permanence des protéines dont certaines deviendront des résidents permanents de la cellule (protéines domestiques) et d’autres seront exportées à l’extérieur de la cellule. Le choix d’entrer ou pas dans la voie sécrétoire est déterminé par la présence ou l’absence d’un peptide signal à l’extrémité N-terminale des polypeptides. La particule de reconnaissance du signal, assemblée dans le nucléole et exportée dans le cytosol, joue un rôle déterminant dans l’adressage des protéines : elle reconnaît le peptide signal sur le polypeptide en cours de synthèse et émergeant de la grosse sous-unité ribosomiale ; elle se lie à ce peptide ainsi qu’à un récepteur de la membrane du réticulum endoplasmique. Cette double reconnaissance assure l’arrimage de l’ensemble ribosome – polypeptide naissant à la membrane du reticulum, qui est la porte d’entrée de la voie sécrétoire.

Le nucléole n’est pas seulement une usine à ribonucléoprotéines ; c’est aussi le lieu de synthèse ou de transit d’ARN non codants de petite taille : les petits ARN nucléaires (small nuclear RNA, snRNA) et les petits ARN nucléolaires (Small NucleOlar RNA, snoRNA). Ces derniers donnent naissance à des snoRNP (RiboNucleoProteins Small NucleOlar) associés à la fibrillarine, une protéine de la zone fibrillaire dense (également présente dans les corps de Cajal), et participent au processus de maturation des ARNr. L’ARN U6, associé à des ARN et à des protéines, forme le splicéosome, une particule qui intervient dans la maturation des ARNm. Le nucléole exerce un rôle dans l’organisation du noyau et le contrôle du cycle cellulaire.

Formation d’un nucléole in vitro
Formation d’un nucléole in vitro.  Un transgène de pré-ARNr a été artificiellement inséré dans un chromosome polytène ; le chromosome recombiné est placé dans un milieu contenant les ingrédients nécessaires à la transcription. Une matrice de protéines et d’ARN s’organise spontanément, au sein de laquelle apparaissent des ribonuléoprotéines 80S, les précurseurs des sous-unités ribosomiales.

 

La faible réactivité du nucléole à la coloration de Feulgen suggère qu’il ne contient pas ou très peu d’ADN. Pourtant, en 1931, le botaniste E. Heitz signala la présence de chromosomes au contact du nucléole de la cellule végétale. L’existence de chromatine nucléolaire (ADN nucléolaire) fut confirmée et sa fonction, élucidée par des expériences d’ingénierie génétique. En 1934, la botaniste et cyto-généticienne Barbara McClintock (California Institute of Technology) montra que le nucléole se positionne sur une région particulière du chromosome, qu’elle baptisa « organisateur nucléolaire ». Pour démontrer l’existence de cette région organisatrice des transgènes codant pour des pré-ARNr furent insérés dans des chromosomes polytènes isolés et incubés dans un milieu de transcription : des nucléoles se formèrent spontanément (les chromosomes polytènes sont visibles au microscope optique). L’appellation « organisateur nucléolaire » est aujourd’hui remplacée par celle de « région organisatrice nucléolaire » (Nucleolar Organizer Region). Les organisateurs sont formés de centaines de gènes d’ADNr (un millier dans les cellules végétales) dont les séquences sont répétées en tandem et orientées dans le même sens. Ce regroupement des gènes favorise l’efficacité et la rapidité de la transcription. Entre deux gènes d’ADNr se trouve le gène codant pour l’ARNr 5S. Les régions organisatrices existent à plusieurs exemplaires sur les chromosomes portant les gènes d’ADNr : sept copies du gène d’ADNr sur le chromosome circulaire d’Escherichia coli ; environ 200 copies sur plusieurs chromosomes de Drosophila : 400 copies par génome diploïde, répartis en dix groupes à l’extrémité de cinq chromosomes, dans les cellules humaines. Dans les cellules de glande salivaire de la larve de Drosophila, on a démontré que des gènes spécifiques contrôlent l’activité et la composition du nucléole. Ces « gènes nucléolaires » sont présents dans les régions organisatrices nucléolaires des chromosomes portant les gènes d’ADNr ; ils sont disposés tête-bêche en tandems séparés les uns des autres par des « espaceurs non transcrits », parfois de grande taille, jusqu’à 30 kilobases chez l’homme.

Quel est l’auteur de manuel de biologie cellulaire ou moléculaire qui a résisté à la tentation de montrer la spectaculaire micrographie d’« arbres de Miller » ou « arbres de Noël », prise en 1969 par Oscar L. Miller et Barbara R. Beaty (Department of Biology, University of Virginia) dans des oocytes de Xénope ? Ils sont la visualisation du regroupement de dizaines de gènes d’ADNr en un seul locus et de leur transcription par l’ADN polymérase I. Il subsiste de nombreuses interrogations sur les relations entre structure et fonction au sein du nucléole et sur le mode d’assemblage des ribonucléoprotéines ; leurs éléments constitutifs, protéines robosomiales et ARNr, sont synthétisés dans deux compartiments distincts de la cellule : le cytoplasme et le nucléole. Il reste des points à préciser sur la relation entre les zones morphologiquement identifiables – zone dense fibrillaire, centres fibrillaires, zone granulaire – et les fonctions de synthèse des ARNr, de maturation des ARNr et d’assemblage des ribonucléoprotéines.


Chimie du noyau

Les chimistes commencèrent à s’intéresser au noyau au XIXe siècle. A cette époque, la chimie organique structurale connaissait en Allemagne un spectaculaire développement. Entre les années 1840 et 1870, la recherche en biochimie (la discipline n’existait pas encore) se faisait dans les écoles de médecine des universités allemandes, puis dans les facultés de philosophie (facultés des sciences). En 1845, les autorités de la Eberhard Karls Universität de Tübingen créèrent la première chaire de chimie physiologique et la confièrent à un pionnier de cette discipline : Julius E. Schlossberger. Au départ, cette chaire avait été créée « à titre personnel » ; elle devint permanente et le chimiste organicien Ernst Felix Immanuel Hoppe, qui se faisait appeler Hoppe-Seyler, prit la succession de Schlossberger. Hoppe-Seyler choisit comme thème de recherches la composition chimique du protoplasme.

Son élève, Johan Friedrich Miescher, entreprit l’étude du noyau ; il était convaincu que la composition chimique de cet organite devait être radicalement différente de celle des autres parties de la cellule. Miescher avait étudié la médecine à l’Université de Bale. Atteint de surdité à la suite d’une attaque de typhus, il renonça à la pratique médicale, opta pour la recherche et suivit une formation de chimiste organicien dans le laboratoire d’Adolf Stecker, à Göttingen. Il choisit comme matériel expérimental les leucocytes (les globules blancs du sang) ; ils possèdent un volumineux noyau et l’on peut en récolter de grandes quantités par lavage de pansements imprégnés de pus avec une solution de sulfate de sodium. Miescher sépara les noyaux et les soumit à une hydrolyse acide en présence d’extrait d’estomac de porc (comme source de pepsine) pour éliminer les protéines, et à une extraction par des solvants organiques pour éliminer les lipides. Après filtration et centrifugation, le culot était dissout en milieu alcalin.

Miescher obtint une solution visqueuse, d’acidité élevé (c’était le matériel biologique le plus acide jamais isolé), soluble dans les solutions alcalines, insoluble dans l’eau ou les solvants acides et riche en phosphore (10% de la masse). On ne connaissait à l’époque que deux composés biologiques contenant du phosphore : la caséine, une phosphoprotéine du lait isolée par Gerrit Mulder en 1837, et la lécithine, un phospholipide isolé dans le laboratoire d’Hoppe-Seyler. L’extrait nucléaire fut baptisé « nucléine » (1869). Miesscher rédigea un article qu’il soumit à Hoppe-Seyler, éditeur de la revue Medizinisch-chemishe Untersuchungen. Confronté au caractère novateur, pour ne pas dire révolutionnaire, des résultats de Miescher, Hoppe-Seyler adopta une attitude prudente, sinon ambiguë : il retarda de deux ans la publication du manuscrit aux fins de vérifications par deux de ses élèves. L’article intitulé « Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen » fut finalement publié en 1871. Miescher retourna en Suisse, son pays natal, où il occupa la chaire de physiologie de l’Université de Bâle. Il poursuivit ses travaux en utilisant comme matériel biologique le sperme de saumon du Rhin, une source particulièrement riche en nucléine ; il en isola un matériel protéique basique : la protamine.

A partir de 1877, K.M.L. Albrecht Kossel poursuivit, dans le laboratoire de Hoppe-Seyler, les travaux entrepris par Friedrich Miescher sur la nucléine. L’année suivante, il publia un premier article sur une méthode de préparation de la nucléine ; après hydrolyse, il isola deux bases, l’hypoxanthine et la xanthine. Salomon et Chittenden, qui avait déjà isolé la xanthine, croyaient que cette base dérivait des protéines ; Kossel montra que la xanthine provient de la nucléine (hypoxanthine et xanthine sont des produits de désamination des « vraies » bases des acides nucléiques : l’adénine et de la guanine, provoquée par les conditions énergiques d’hydrolyse). Kossel poursuivit ses investigations avec l’isolement de l’adénine à partir de pancréas, puis de nucléine (1885). En 1888, Altmann obtint une préparation de nucléine de levure très peu contaminée par des protéines. Kessel en analysa un échantillon en 1891 et isola, outre de l’acide phosphorique et un sucre, deux bases : guanine et adénine, puis, en 1893, avec son étudiant Neumann, la thymine et la cytosine (dont les structures s’apparentent à celle de la pyrimidine). Un autre de ses étudiants, Ascoli, découvrira l’uracile en 1901. En plus des bases, Kossel isola aussi des sucres : l’un était un pentose ; l’autre se décomposait en acide lévulinique (en C5) et acide formique (en C1) ; il en conclut erronément qu’il s’agissait d’un hexose.

Il fallut vingt ans d’efforts (de 1880 à 1900) à Emil Hermann Fischer (prix Nobel de chimie en 1902) et à ses collaborateurs pour établir la formule des différentes bases qui avaient été isolées. Fischer était un chimiste réputé ; il avait découvert la liaison peptidique et montré, en 1900, que les protéines sont des polymères d’acides aminés (le terme « protéine » fut inventé par le chimiste Jön Jacob Berzelius et son emploi, généralisé à partir de 1839 par Gerardus Johannes Mulder, spécialiste des albumines). Recourant aux techniques de la chimie organique structurale, Fischer suivit la stratégie par analyses et rétro-synthèses que Friedrich Whöler avait mise au point pour établir la structure de l’urée. Il montra que la structure chimique de l’adénine et de la guanine dérive de celle de la purine (une molécule dont le nom rappelle sa parenté structurale avec l’urée) ; la structure de la thymine et de la cytosine dérive de celle de la pyrimidine.

Kossel renonça à poursuivre son travail sur les acides nucléiques : il lui était difficile de concevoir que des molécules aussi simples, composées de seulement quatre bases différentes, puissent rendre compte de la diversité des formes vivantes. Il se tourna vers l’étude des protéines qui, avec leurs vingt acides aminés différents, lui paraissaient plus prometteuses. En 1884, il découvrit l’histone, une protéine basique associées à l’ADN et différente de la protamine isolée par Friedrich Miescher. En 1895, Kossel isola un nouvel acide aminé, l’histidine. Il reçut en 1910 le prix Nobel de médecine ou physiologie. Il eut de nombreux élèves, parmi lesquels Walter Jones ou Phoebus Levene pour ne citer qu’eux, qui continuèrent à explorer avec succès le domaine des acides nucléiques.

Hydrolyse chimique des nucléoprotéines
Protocole d’hydrolyse chimique des nucléoprotéines. Ce schéma d’hydrolyse fut utilisé jusqu’au milieu du XXe siècle. L’hydrolyse chimique ménagée, combinée à l’hydrolyse enzymatique, libère un mélange de bases, pentoses, pentoses phosphate, nucléosides, nucléotides et oligonucléotides. Le terme « protamine » désigne aujourd’hui des protéines basiques exprimées dans les spermatocytes et jouant un rôle analogue à celui des histones.

 

En 1889, le terme nucléine fut remplacé par l’appellation « acide nucléique » sur proposition de Richard Altmann. Walther Flemming inventa, en 1879, le terme « chromatine » pour désigner le matériel nucléaire fixant fortement les colorants basiques. En 1881, Eduard Zaccharias montra que les termes chromatine et nucléine désignent le même matériel, réagissant de la même façon aux traitements acide ou alcalin. D’autres appellations firent leur apparition, comme celle d’acide « zymonucléique », pour désigner le matériel extrait des levures et des plantes. La notion prévalait que cette nucléine était différente de la celle extraite des tissus animaux, baptisée acide « thymonucléique ». Ces appellations restèrent en usage jusqu’à la fin des années 1940 et même au-delà. Elles tombèrent finalement en désuétude au profit d’« acide ribonucléique » (ARN) et « acide désoxyribonucléique » (ADN).

La preuve qu’ADN et ARN coexistent dans les cellules végétales et animales fut apportée par le chimiste et physiologiste Robert J.W. Feulgen. Les colorants basiques réagissent avec les deux acides nucléiques. Pour les différencier, Feulgen et H. Rossenbeck publièrent, en 1924, une technique de coloration spécifique de l’ADN. L’échantillon tissulaire était hydrolysé en milieu acide dans des conditions où les liaisons N-osidiques entre purines et pentoses étaient rompues ; le groupe aldéhydique du désoxyribose était libéré, mais pas celui du ribose, le sucre présent dans l’ARN. La réaction de la fuschine (réactif de Schiff) sur le groupe aldéhydique libre (celui du désoxyribose) donnait une coloration pourpre. La coloration de coupes provenant du même échantillon tissulaire par le réactif de Feulgen (ADN) ou par des colorants basiques (ADN et ARN) mit en évidence la présence des deux types d’acides nucléiques dans les cellules animales et végétales. Dans les années 1920, Walter Jones et M. E. Perkins purifièrent de l’ARN à partir de tissus animaux, tandis que J.E. Jorpes parvint à extraire de l’ADN et de l’ARN à partir de plantes et d’animaux.

La structure et de la composition des acides nucléiques fut définitivement connue à la suite des travaux de Phoebus A. Th. Levene (Rockefeller Institute for Medical Research). Après avoir étudié la médecine à Saint-Petersbourg, il émigra aux Etats-Unis (New York) où il combina la pratique médicale dans le quartier déshérité du Lower East Side et un poste d’étudiant chercheur à Columbia University. Atteint de tuberculose, il dut interrompre ses activités et profita de périodes de convalescence entre 1896 et 1905 pour séjourner dans le laboratoire de deux chimistes réputés : Albrecht Kossel et Emil Fischer. Il commença, en 1895, par étudier la composition et la structure d’un acide nucléique « simple », selon la terminologie de l’époque, c’est-à-dire formé d’un seul nucléotide et une seule base. Avec la collaboration de W. Jacobs, il isola en 1909, à partir d’un acide inosinique d’origine animale, un pentose qu’il identifia au D-ribose, un sucre qui avait été synthétisé en 1891 par Emil Fischer et Oskar Piloty (Université Humboldt, Berlin). Levene et Jacobs s’attaquèrent ensuite à un acide nucléique complexe (renfermant un grand nombre de bases), l’acide zymonucléique, dont ils isolèrent du ribose et un nucléoside (terme créé par Levene pour désigner un composé formé d’un sucre et d’une base) : la guanosine.

Tous ces composés étaient isolés par hydrolyse chimique du matériel biologique (en milieu acide ou alcalin) ; cette méthode agressive provoquait la dénaturation de certaines bases. En 1907, Walter Jones utilisa l’hydrolyse enzymatique avec des extraits de pancréas (contenant des nucléases). Levene fut à son tour converti à cette technique par son ancien professeur de physiologie à l’Université de Saint-Petersbourg, Ivan P. Pavlov (prix Nobel de médecine ou physiologie en 1904) de passage à New York en 1923. Pavlov était un pionnier de la collecte des sécrétions gastrique ou intestinale par canulage. Levene se rendit à Saint-Petersbourg et Efrim S. London, un élève de Pavlov, vint à New York pour lancer la technique du double canulage gastrique et intestinal au Rockefeller Institute. En 1929, Levene et London établirent que le sucre présent dans l’ADN n’est pas un hexose, comme le prétendait Albrecht Kossel, mais un pentose, le désoxyribose, dont la structure (2-désoxyribo furanose) sera déterminée en 1935. Il était dès lors établi que les acides nucléiques sont composés de bases, de sucres et de phosphate. Il restait à déterminer comment et dans quel ordre ces molécules sont liées les uns aux autres ; c’est à cette tache que s’attelèrent le groupe de New York (Levene et Jacobs) et celui d’Uppsala (Ivar Christian Bang et Olof Hammarsten). En 1909, Levene et Jacobs montrèrent que, par hydrolyse alcaline, l’acide inosinique libère une base et du ribose phosphate et par hydrolyse acide, un nucléoside et du phosphate. Ces résultats indiquaient que l’ordre d’association était : base-sucre-phosphate, et qu’il existait une liaison β-N-glycosidique entre la base et le carbone C1’ du 2’-désoxyribose.

Les travaux de Phoebus Levene (Rockefeller Institute) aboutirent à la conclusion que l’ordre d’association des composants des acides nucléiques était : phosphate – pentose – base. Levene donna à cet ensemble de trois éléments le nom de nucléotide et proposa un modèle d’ADN formé par l’association de nucléotides par l’intermédiaire des groupes phosphate. Quel était la nature des liaisons au sein du squelette ? En 1902, deux spécialistes de la chimie des protéines, Thomas B. Osborne et Isaac F. Harris (Connecticut Agricultural Experiment Station) proposèrent l’un des premiers modèle de structure pour une molécule d’acide nucléique (de germes de blé) : une seule chaîne de quatre phosphates liés entre eux par des liaisons pyrophosphate ; le pentose et les bases étaient directement attachés à ce squelette par des liaisons covalentes. En 1909, Levene présenta un modèle dans lequel les bases étaient attachées au squelette tétrapyrophosphate par l’intermédiaire de pentoses. Il apparut rapidement que ces modèles n’étaient pas compatibles avec le fait que l’un des deux acides nucléiques (l’ARN) était hydrolysable en milieu faiblement alcalin. Cette propriété excluait l’existence de liaisons pyrophosphate et plaidait plutôt en faveur de la présence de liaisons ester. Il fut établi que les pentoses de deux nucléotides adjacents du squelette de l’ADN sont unis entre eux par des liaisons 3’-5’ phosphodiester. Il en est de même pour le squelette de l’ARN, comme le montrèrent, en 1952, D.M. Brown et A.R. Todd (Cavendish Laboratory, University of Cambridge) [2].

Restait à résoudre le problème du rapport molaire entre les bases : adénine (A), guanine (G), thymine (T) ou uracile (U), cytosine (C). En 1893, Albrecht Kossel et son élève Neumann étaient arrivés à la conclusion qu’il y avait autant de purines que de pyrimidines. Pour l’ARN de germes de blé, Osborne et Harris avait calculé que le rapport entre les bases était G/A/2U (ils n’avaient pas détecté la cytosine). Le rapport exact pour l’ADN (A/G/C/T) fut déterminé en 1909 par Levene et celui pour l’ARN (A/G/C/U), par Walter Jones en 1914. Selon le modèle de structure publié par Levene en 1910 (quatre bases liées à un squelette désoxyribose-phosphate dans le rapport stoechiométrique rapporté ci-dessus, l’ADN était un tétranucléotide : T-A-C-G. Levene passa complètement à côté de la nature macromoléculaire de l’ADN et des variations de séquence des bases. S’il ne fut pas le seul à commettre cette monumentale erreur (loin de là !), il fut le seul, avec ses 700 articles scientifiques publiés, à jouir d’une autorité internationale incontestée ; ce qu’il disait était parole d’évangile pour la communauté scientifique gravitant autour des acides nucléiques et de la transmission des caractères héréditaires. Le modèle du tétranucléotide, et sa variante du « polytétranucléotide »,

TACG TACG TACG TACG

furent adoptés pendant 40 ans. Le consensus était que la molécule d’ADN devait avoir une longueur d’une dizaine de nucléotides et que la séquence des bases était monotone et répétitive. Le généticien Max L.H. Delbrück (co-lauréat du prix Nobel de médecine ou physiologie en 1969 et père fondateur du Groupe du phage) qualifiait l’ADN de « molécule stupide ». Difficile d’imaginer qu’elle puisse être porteuse d’un quelconque message ; l’intérêt se porta plutôt sur les protéines basiques associées à l’ADN et leurs vingt acides aminés différents, qui semblaient mieux armées pour servir de support à la transmission des caractères héréditaires.

L’ADN est une macromolécule

La situation évolua rapidement lorsqu’un certain nombre de groupes décidèrent de perfectionner la méthode d’extraction de l’ADN. John M. Gulland et Denis O. Jordan (University College, Nottingham) évitèrent le recours à l’hydrolyse chimique acide ou alcaline et conservèrent la préparation à un pH voisin de la neutralité à toutes les étapes de la purification ; ils isolèrent à partir de thymus de veau des fibres d’ADN peu dégradées. Avec ce produit très purifié, ils démontrèrent en 1947 l’existence de liaisons hydrogène entre les groupes aminés et hydroxyle des bases par titration électrométrique avec un acide fort ou une base forte. C’était un premier pas vers la structure hélicoïdale de l’ADN.

Les chercheurs scandinaves : Olof Hammarsten (Uppsala universitet), Einar Hammarsten, Harald Hammarsten, Ivar Bang (Lund universitet), Theodor Svedberg, Torbjörn O. Caspersson (Karolinska Institutet) adoptèrent une stratégie similaire : extraction de l’ADN à basse température et à un pH voisin de la neutralité. Ils séparèrent un matériel blanc, floconneux, très visqueux, précipitant spontanément en longues fibres au fond des récipients. Ivar Bang ajouta au processus de purification de l’ADN une étape de précipitation par un sel de sodium, pour diminuer au maximum la contamination par les protéines (soupçonnées par certains d’être le support de l’hérédité). Son élève, Einar Hammarsten, fit une évaluation de la taille de ce qu’il croyait être des « particules colloïdales » d’ADN, selon la conception en vigueur à l’époque. Cette notion de colloïde avait été introduite par le physico-chimiste Thomas Graham alors qu’il s’intéressait à la nature physique des protéines. Il tenta de séparer par dialyse d’extraits organiques des cristaux et des « colloïdes », et parvint à la conclusion que certaines protéines, comme la gélatine, étaient des colloïdes alors que d’autres étaient cristallisables. Il lança l’idée que l’état colloïdal était une spécificité du vivant.

Pour mesure la taille des particules d’acide thymonucléique, Einar Hammarsten et Torbjörn Caspersson sollicitèrent, en 1936, la collaboration du biophysicien Rudolf Signer. Ancien collaborateur d’Hermann Staudinger (prix Nobel de chimie en 1953, créateur, en 1922, du terme « macromolécule »), Signer était un spécialiste de la biréfringence de flux. Cette technique met en jeu la double réfraction de rayons lumineux et permet d’estimer la taille et la forme de molécules en solution. Lorsque l’on force la solution à s’écouler dans un tube de très faible diamètre toutes les molécules ont tendance à s’orienter dans le même sens, qui est le sens du flux. Dès 1934, Torbjörn Caspersson et Einar Hammarsten avaient démontré que l’ADN est une macromolécule. Les résultats définitifs publiés [3] en 1938 avec Rudolf Signer créèrent la surprise, pour ne pas dire le choc : la longueur de la molécule d’ADN équivalait à trois cent fois son diamètre et sa masse était comprise entre 500.000 et 1.000.000 ! La technique permettait même de conclure que le plan des bases devait être perpendiculaire au grand axe de la molécule ! En 1950, Signer analysa une préparation dont les molécules avaient une masse de 7.000.000 ! Les Scandinaves et leurs associés devinrent les grands pourvoyeurs d’ADN purifié. En 1937, Torbjörn Caspersson donna l’échantillon d’ADN de thymus de veau qui permit au physicien William Astbury (Davy-Faraday Laboratory, Royal Institution, London) d’entreprendre son travail de pionnier sur la structure spatiale de cette macromolécule par diffraction des rayons X. Rudolf Signer fournit les préparations à partir desquelles les physiciens britanniques établirent la structure en double hélice de l’ADN.

Devant ces résultats, Phoebus Levene jugea qu’il devait réévaluer la taille des molécules d’ADN qu’il utilisait ; avec Gerhard Schmidt, il mesura leur masse par centrifugation à haute vitesse. Les valeurs mesurées étaient comprises entre 200.000 et 1.000.000. Levene ne voulut pas voir à quel point ce résultat invalidait son modèle du (poly)tétranucléotide ; en s’imposant pendant près d’un demi siècle à la communauté scientifique, ce modèle avait freiné tout progrès des connaissances sur la véritable fonction des acides nucléiques dans la cellule. Malgré l’importance de sa contribution à l’établissement de la structure des acides nucléiques, Phoebus Levene ne fut pas récompensé par l’attribution du prix Nobel.

Division des cellules et croissance des tissus : rôle du noyau

Avant d’aborder ce paragraphe, un petit rappel s’impose. En 1824, le médecin et biologiste Jean-Louis Prévost et l’apprenti pharmacien Jean-Baptiste Dumas, qui allait devenir un chimiste de renom international, mirent en évidence le rôle du spermatozoïde dans la fécondation et le processus de segmentation de l’œuf fécondé. La partition de l’œuf en 2, 4, 8, etc. cellules embryonnaires (appelées blastomères) fut confirmée par Mauro Rusconi (Université de Pavie) en 1826. L’œuf des mammifères fut découvert en 1827 par Karl E. R. von Baër, professeur à l’Université de Königsberg et pionnier de l’embryologie.

La contribution du médecin et embryologiste Robert Remak (Hôpital de la Charité, Berlin) fut décisive. C’est lui (et non Rudolf Virchow qui s’en attribua le mérite) qui établit, en 1852, que toute cellule provient de la division d’une cellule préexistante, que la division du noyau (caryocinèse) précède la division cellulaire (cytocinèse) (voir paragraphe « Théorie cellulaire » dans le chapitre II). Dans un texte de 1855 intitulé « Untersuchungen über die Entwickelung der Wirbelthiere » il publia le résultat de ses travaux sur le développement de l’œuf fécondé ; il décrivit les étapes du passage aux blastomères et du développement des trois feuillets embryonnaires – ectoderme, mésoderme et endoderme – par division des cellules embryonnaires (les feuillets embryonnaires sont des couches de cellules à partir desquelles se développe l’embryon). En 1858, il nota l’apparition de filaments dans le noyau au début de la division cellulaire, une observation qui avait été faite dix ans plus tôt par le botaniste autodidacte Wilhelm F.B. Hofmeister dans le noyau des cellules végétales.

Les premières études sur la la fécondation chez des organismes vivants furent réalisées par Oscar Hertwig, professeur d’anatomie à l’Université de Berlin et disciple du botaniste Ernst Haeckel, professeur à l’Université d’Iéna, directeur de l’Institut de Zoologie et propagandiste du darwinisme en Allemagne. Haeckel avait la conviction qu’il existait une relation entre hérédité et noyau. En 1850, Nicholas A. Warneck avait signalé que l’œuf fécondé renferme deux pronuclei (le terme « pronucléus » désigne le noyau de l’ovule ou du spermatozoïde, après fécondation). En 1873, le zoologiste Johann A.O. Bütschli fit une observation similaire : l’oeuf fécondé d’un Nématode possède deux noyaux et ces noyaux fusionnent, phénomène qui fut aussi remarqué par L. Auerbach en 1874.

Hertwig séjourna à la station de zoologie marine de Villefranche-sur-mer à la recherche d’un matériel expérimental adapté à ses travaux ; il porta son choix sur l’étoile de mer et surtout sur l’œuf d’oursin, dont la transparence lui permit d’examiner l’intérieur de la cellule au microscope et de découvrir, en 1876, le mécanisme de la fertilisation. Le phénomène de fusion des noyaux des cellules reproductrices mâle et femelle décrit par Hertwig fit l’objet d’études approfondies par Hermann Fol (Université de Genève), un autre élève d’Ernst Haeckel. Après fécondation, le noyau provenant du spermatozoïde est d’abord situé à la périphérie de l’ovule, puis il s’en rapproche et fusionne avec lui et donner naissance à une cellule œuf. Hertwig rejetait l’idée que le cytoplasme puisse être le gardien de l’hérédité en se basant sur un raisonnement qui sera souvent repris par la suite : si le cytoplasme était le site de transmission des caractères héréditaires, on s’attendrait à ce que le cytoplasme de l’ovule et celui du spermatozoïde aient à peu près le même volume, ce qui n’est pas le cas ; celui de l’ovule est beaucoup plus volumineux que celui du spermatozoïde. Par contre, les noyaux du spermatozoïde et de l’ovule ont sensiblement la même taille.

Mitose

Les chromosomes ne sont pas visibles pendant l’interphase (entre deux divisions cellulaires) ; les seuls qui le soient sont les chromosomes géants des glandes salivaires ou de l’intestin des larves de diptères, comme Drosophila melanogaster, découverts en 1881 par Edouard Gérard Balbiani (Collège de France, Paris), puis, en 1882, par Walther Flemming. et dans les ovocytes télolécithes des vertébrés (œuf de poule, par exemple), en 1892, par l’embryologiste Julius Rückert. Les chromosomes des cellules eucaryotes ne deviennent visibles qu’au moment de la mitose de la division cellulaire. La condensation de la chromatine en chromosomes fut décrite en 1842 dans le noyau des cellules végétales par le botaniste Karl Wilhelm von Nägeli.

Gérard Balbiani décrivit la métaphase de la mitose, mais il éprouva des difficultés à évaluer correctement ses données expérimentales : il utilisait des Protozoaires pour étudier la reproduction sexuée et la présence de deux noyaux (macronucléus et micronucléus) compliquait l’interprétation des résultats. Il eut moins de problèmes avec la mitose des cellules de l’épithélium ovarien de la sauterelle Stenobothorus. Bien que l’on ne puisse lui attribuer le mérite d’avoir compris le phénomène de la mitose dans sa totalité, on peut reconnaître à Balbiani le mérite d’avoir rapporté un certain nombre d’observations intéressantes : la disparition du noyau au début de la mitose, l’apparition de « bâtonnets » de tailles inégales et leur division en deux bâtonnets. La présence de bâtonnets avait déjà attiré l’attention d’Edouard van Beneden. Il avait suivi leur regroupement en deux amas au voisinage de la plaque équatoriale et leur migration, en s’éloignant les uns des autres, vers les ébauches de noyaux des deux cellules filles.

Les principales étapes de la division cellulaire par mitose : prophase (condensation de la chromatine en chromosomes), métaphase (alignement des paires de chromatides dans le plan équatorial du fuseau mitotique), anaphase (séparation des paires de chromatides et migration vers les pôles du fuseau mitotique), télophase (reconstitution des noyaux) furent décrites par un certain nombre de scientifiques au premier rang desquels il faut citer le botaniste Eduard Strasburger (Botanisches Institut, Universität Bonn) et le biologiste Walther Flemming (Universität Kiel). Leurs écrits n’étant cependant pas exempts d’inexactitudes, en particulier ceux de Strasburger, il faut aussi rendre justice aux contributions d’Otto Bütschli, de Waclaw Mayzel, de W. Schleicher ou de P. Peremeschko. W. Schleicher inventa en 1878 le mot « caryocinèse » pour désigner la division du noyau. Ces découvertes furent rendues possible par les perfectionnements apportés aux microscopes pendant la décade 1830-1839 et par l’introduction de nouvelles méthodes de coloration de la chromatine. Strasburger fut particulièrement inventif dans le domaine de la fixation et de la coloration des tissus végétaux, au point de déconcerter ses collègues : au Congrès de Botanique d’Amsterdam de 1877 ils taxèrent ses résultats d’artefacts.

Condensation de la chromatine en chromosomes au moment de la division cellulaire
Condensation de la chromatine en chromosomes pendant la transition de l’interphase à la prophase de la mitose. Dessin de gauche : enroulement des chromosomes en fibres ; dédoublement du centrosome. Dessin de droite : à la prophase, les chromatides appariées prennent l’apparence de filaments épais, les microtubules du fuseau mitotique sont visibles, les centrosomes sont diamétralement opposés, de part et d’autre du noyau.

 

Strasburger était un disciple du botaniste Ernst Haeckel. Il étudiait la fécondation chez les conifères et les plantes à fleurs ; chez l’éphémère (Tradescantia) ou fritillaire (Fritillaria persica), il est possible de suivre au microscope le passage du noyau mâle dans le tube pollinique et sa progression vers le sac embryonnaire en traversant le pistil ; cette particularité permet de suivre la fusion des noyaux mâle et femelle. Strasburger réalisa que la division des cellules végétales et des cellules animales présente de grandes similitudes. En 1879, il décrivit les étapes de la mitose, la division de la cellule en deux cellules filles, la scission concomitante du noyau de la cellule mère en deux noyaux, l’apparition dans le noyau de bâtonnets fortement colorables et leur scission en deux. Strasburger avait ses limites ; il commit des erreurs d’appréciation. Comme Balbiani, il crut que la scission des chromosomes était transversale. Il reprit à son compte la thèse du cytoblastème exposée par Schleiden dans l’édition de 1875 de « Zellbildung und Zellteilung », et conclut que le noyau était synthétisé de novo. Il soutint que le mode de division différait selon le type de cellule. Comme auteur, Strasburger détient un record de longévité : son « Lehrbuch der Botanik für Hochschulen », publié en 1894, devint un « best seller » dont les éditions se succédèrent pendant tout le XXe siècle.

Walter Flemming utilisait comme matériel expérimental la salamandre (Salamandra maculata) dont certaines cellules possèdent de volumineux noyaux. Il observa la duplication et la scission longitudinale des « filaments » au cours de la mitose des cellules épithéliales de la larve. Fleming ne fut pas le premier à dire que la scission est longitudinale et non transversale comme le croyaient Balbiani et Strasburger ; W. Schleicher l’avait vu avant lui. Tout en contestant les résultats de Schleicher, Strasburger eut l’honnêteté de répéter ses expériences sur des plantes à fleur (ses premiers travaux portaient sur les conifères). Enfin convaincu que la scission était bien longitudinale, il obligea son éditeur à interrompre la vente de « Zellbildung und Zellteilung » et racheta, sur ses deniers, les exemplaires déjà vendus. En 1878, Fleming donna une image d’ensemble de la mitose assez conforme à la réalité, à l’exception d’un fait capital qui lui échappa totalement : la migration vers les pôles opposés de la cellule des deux nouveaux filaments après la scission. Si Strasburger et Fleming mentionnèrent l’existence du fuseau mitotique, ils eurent du mal à interpréter correctement son rôle dans la division cellulaire. Ils ne furent pas les seuls ; le zoologiste Johan A.O. Büstchli et Oskar Hertwig croyaient que les filaments (chromosomes) étaient le produit de la dilatation des fibres du fuseau mitotique.

Méïose

Deux noms sont associés aux travaux ayant mené à la découverte de la division cellulaire avec réduction de moitié du nombre de chromosomes : ceux d’Edouard J.L.M. van Beneden (Université de Liège) et de Theodor Boveri (Zoologisches Institut Munchen, puis Universität Würzburg). Edouard van Beneden était le fils de Pierre-Joseph van Beneden, professeur de zoologie à l’Université Catholique de Louvain. C’est sous son égide que le jeune Edouard commença à s’intéresser aux vers et à leurs embryons. C’est ainsi qu’il découvrit le matériel idéal pour étudier la division des gamètes : l’œuf d’Ascaris megalocephala (de la sous-espèce univalens),. Ce vers hermaphrodite, parasite de l’intestin des chevaux, possède la particularité d’avoir des cellules somatiques transparentes et ne possédant qu’un nombre réduit de chromosomes bien individualisés : quatre et même deux dans certaines espèces), faciles à distinguer les uns des autres et conservant leurs caractères morphologiques d’une génération à l’autre. Edouard van Beneden publia ses résultats en 1883 dans les Archives de Biologie : dans le noyau des ovules et dans celui des spermatozoïdes, le nombre de chromosomes était égal à la moitié de celui dans les noyaux des cellules somatiques (deux dans l’espèce d’Ascaris utilisée). Il commit cependant l’erreur de croire que la méiose était une division cellulaire d’un type particulier, avec expulsion d’un globule polaire.

Après avoir observé le développement des œufs d’Ascaris megalocephala et d’Ascaris univalens, Theodor Boveri proposa un mécanisme de la division réductive en deux étapes, dont les détails furent précisés par Oscar Hertwig (Universität Berlin). La réplication de l’ADN chromosomique donne naissance à deux chromatides par chromosome, comme dans la mitose. Au cours de celle-ci, les chromatides-sœurs provenant de chaque chromosome homologue demeurent liées l’une à l’autre au niveau d’une structure nucléoprotéique appelée « kinétochore » jusqu’au moment de leur séparation et de leur migration vers les pôles opposés du fuseau mitotique. Dans la méiose, les paires de chromatides provenant de deux chromosomes homologues s’apparient, formant des groupes de quatre chromatides qui s’alignent dans le plan équatorial du fuseau mitotique. La cellule diploïde subit deux divisions successives, la méiose I et la méiose II, donnant naissance à quatre gamètes haploïdes, du moins pour les spermatozoïdes. Pour les gamètes femelles, les ovules, la méïose I aboutit à la production d’un ovule et d’un globule polaire (corps polaire) ; il en va de même de la méïose II. La division d’un ovule diploïde mène in fine à la production d’un pronucléus haploïde et de deux ou trois globules polaires.

Mitose et méïose
Mitose et méïose. Au début de la mitose, chaque chromosome d’une paire homologue est dupliqué en deux chromatides visibles au microscope optique à la fin de la prophase. Elles sont liées l’une à l’autre par leurs centromères au niveau du kinétochore. Au début de la méïose (stade diplotène), deux paires de chromatides, provenant d’une paire de chromosomes homologues, s’associent en des points particuliers – les chiasmas – pour former des tétrades, ou bivalents. Du matériel génétique est échangé entre chromosomes homologues (flèches).

 

La contribution de Boveri ne se limita pas au mécanisme de la méiose. Walther Flemming avait noté la présence de filaments dans la cellule en interphase, mais il avait commis l’erreur de conclure que les chromosomes étaient jointifs. En 1887 et 1888, après un examen attentif du comportement des chromosomes pendant le développement embryonnaire de l’œuf (zygote) et les divisions des premières cellules (blastomères), Boveri arriva à la conclusion que le nombre et la morphologie des chromosomes restent inchangés au cours de la division du noyau. L’individualité des chromosomes est conservée à l’interphase, comme à la mitose (même si les chromosomes perdent leur forme condensée et deviennent moins visibles) et au cours des divisions successives de la cellule. C’était un argument décisif en faveur de leur rôle dans la transmission des caractères héréditaires. Boveri fut l’un des premiers à attribuer un caractère morphologique spécifique (un trait phénotypique) à un chromosome particulier ; il eut l’intuition que la variabilité et le nombre élevé de caractères héréditaires d’un individu pouvaient s’expliquer par des échanges de « facteurs particulaires » entre chromosomes. Par contre, il fut moins perspicace en interprétant la faible colorabilité des chromosomes à l’interphase comme révélant une perte de substance chromatique. Les chromosomes, croyait-il, se rechargeaient en chromatine au début de la division cellulaire.

Les cellules diploïdes possèdent deux copies de chaque chromosome dont l’une est fournie par le père (le mâle) et l’autre par la mère (la femelle). Se basant sur des critères essentiellement microscopiques, les généticiens regroupent les chromosomes par paires et leur attribuent un numéro. Il existe une paire de chromosomes sexuels identiques chez la femelle (XX), mais pas chez le mâle (XY). Au cours de la méïose, les cellules diploïdes subissent deux divisions cellulaires conduisant à la production de cellules haploïdes. Les gamètes renferment une seule copie de chaque chromosome ; chez les animaux, ils portent le nom de sperme et d’œuf. En 1882, Flemming fit la synthèse des connaissances acquises sur la mitose dans son célèbre ouvrage « Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung » (Substance cellulaire, noyau et division cellulaire).

Terminologie

La partition du matériel nucléaire et des chromosomes entre les cellules filles fut décrite en 1878 par W. Schleicher sur des cellules de larves d’Amphibiens ou de cartilage crânien. Il créa le terme « caryocinèse ». Walter Flemming, en 1882, utilisa celui de « caryo-mitose », qui sera abrégé en « mitose » ; il créa aussi les termes « asters » (formations étoilées apparaissant aux extrémités du fuseau mitotique et à partir desquelles rayonnent les microtubules), « chromatine » (matériel nucléaire possédant une forte affinité pour les dérivés basiques de l’aniline). Les termes « prophase, métaphase, anaphase, cytoplasme, nucléoplasme, diploïde, haploïde, gamète » furent proposés par Eduard Strasburger, et « télophase », par l’anatomiste Martin Heidenhain, en 1894. Le botaniste John Bretland Farmer et J.E. Moore proposèrent le terme « méïose » vers 1905. Les termes « gène, génétique » furent créés par William Bateson, en 1902. Le terme « chromosome » fut utilisé pour la première fois en 1888 par l’anatomiste Heinrich von Waldeyer-Hartz à propos du matériel nucléaire condensé, colorable, apparaissant au début de la division cellulaire ; ce terme désigne aujourd’hui une longue molécule d’ADN bicaténaire associée à des protéines, en particulier à des polypeptides fortement basiques appelés histones.


Centrosome

Walter Fleming, en 1875, et Edouard van Beneden, en 1876, décrivirent une structure intracellulaire apparaissant au moment de la division cellulaire. La réalité de son existence fit l’objet de débats ; pour certains, il ne s’agissait que d’un artefact de coloration. Au début des années 1880, la réalité de son existence ne fut plus mise en doute et Theodor Boveri lui donna le nom de « centrosome ». En 1887, van Beneden et A. Neyt montrèrent qu’au début de la division cellulaire cet organite s’organise à partir d’un centrosome préexistant. Il est formé d’une structure sphérique entourant deux centrioles, dont la division précède celle du noyau. En 1888, Theodor Boveri confirma les observations de van Beneden et décrivit les transformations cycliques des centrioles avant et pendant la prophase de la mitose. Il fit du centrosome le « centre dynamique de la cellule, le centre de division » autour duquel s’organise la partition de l’œuf.

Cellule en mitose
Cellule en mitose. Pendant la phase S du cycle cellulaire, les deux centrioles se dédoublent. Au début de la division cellulaire, les deux nouveaux centrosomes s’éloignent l’un de l’autre pour former les pôles du fuseau mitotique. Dans le plan équatorial du fuseau, les paires de chromatides sont liées aux microtubules du fuseau par leurs kinétochores. Les chromatides se meuvent le long des microtubules du fuseau à l’aide de moteurs moléculaires (dynéines et kinésines) associés aux kinétochores.

 

Le centrosome est situé au centre de la cellule, à proximité du noyau. Dépourvu de membrane, cet organite est entouré de matériel péri-centriolaire amorphe de nature protéique. Son aspect varie selon le type cellulaire ; aussi, fut-il décrit par différents auteurs sous des noms différents. Des centrosomes de grande taille sont présents dans les œufs ; ils sont constitués de deux cylindres creux, que Boveri appela « centrioles » (centriole mère et centriole fille), disposés à angle droit l’un par rapport à l’autre. La paroi des centrioles est formée de microtubules arrangés en triplets, généralement au nombre de neuf. Les centrioles ne sont pas présents dans tous les centrosomes ; ceux de certains protistes, des cellules végétales et des mycètes en sont dépourvus. Les cellules du système nerveux central ayant perdu la capacité de se diviser, comme les neurones, n’ont pas de centrosome.

Cet organite exerce une double fonction : lors de la division des cellules animales, il se dédouble et forme les « centres organisateurs des microtubules », des structures à partir desquelles s’opère la nucléation des microtubules. La polymérisation des microtubules donne naissance au fuseau mitotique, auquel les chromosomes s’accrochent par leur kinétochore. Le fuseau mitotique joue un rôle essentiel dans l’alignement des chromosomes dans le plan équatorial, dans leur migration vers les pôles du fuseau et dans l’égale répartition des chromosomes entre les cellules filles.

Cellule en interphase
Cellule en interphase. Le centre organisateur des microtubules est un lieu de nucléation à partir duquel se forment les microtubules. Ils s’accrochent au centrosome par leur extrémité (-) et s’allongent par leur extrémité (+) en recrutant les molécules de tubuline présentes dans le cytosol. Le réseau de microtubules (il n’y en a généralement qu’un seul par cellule) irradie dans tout le cytoplasme. Pour se déplacer, les organites subcellulaires se fixent sur des protéines motrices liées aux microtubules.

 

Dans la cellule en interphase, le centrosome organise l’assemblage des molécules de tubuline en microtubules qui servent de « rails » aux vésicules assurant le transport antérograde de protéines et de lipides du réticulum endoplasmique à la membrane plasmique, et le transport vésiculaire rétrograde de la membrane plasmique vers les compartiments membranaires internes. Microtubules, filaments d’actine et filaments intermédiaires constituent le cytosquelette qui confère forme et polarité à la cellule et qui, dans certains cas, lui permet de se déplacer.


Nucléine, filaments, noyau

Etablir la localisation subcellulaire précise de l’ADN était une étape indispensable pour comprendre la fonction du noyau dans la cellule ; cette question fut abordée au XIXe siècle. La résistance de la nucléine aux enzymes protéolytiques avait été mise en évidence par Friedrich Miescher. Eduard Zacharias montra que les noyaux d’érythrocytes de crapaud ou de protozoaires ciliés (Paramecium, Vorticella) n’étaient pas affectés par un traitement par la pepsine ; par contre, l’hydrolyse en milieu alcalin faisait disparaître le contenu nucléaire. Eduard Strasburger avait observé que, dans les cellules végétales, une digestion par la pepsine n’affecte pas l’affinité des chromosomes (Kernplatten-elemente) pour les colorants basiques. En 1941, Daniel Mazia (Department of Zoology, University of California, Berkeley) appliqua le protocole expérimental d’Eduard Zacharias aux chromosomes géants de glandes salivaires de diptères (visibles au microscope optique). Le traitement par la pepsine faisait disparaître une partie du matériel chromosomique, mais n’affectait pas l’affinité pour le réactif de Feulgen.

En 1932, Tjorbörn Caspersson (Karolinska Institutet, Stockholm) utilisa un microscope équipé d’un spectrophotomètre pour examiner des coupes de tissus biologiques à différentes longueurs d’onde : en lumière ultraviolette, à 260 nanomètres (pic d’absorption de l’ADN et de l’ARN) ; en lumière visible, après réaction de Feulgen qui ne colore que l’ADN. L’ADN n’était détectable que dans le noyau mais le cytoplasme contenait aussi des acides nucléiques. La réaction basophile du cytoplasme, dûe à la présence d’ARN, avait été signalée par d’autres cytologistes dont Jean Brachet (Université libre de Bruxelles). Caspersson mit aussi en évidence, en 1936, le doublement de la quantité d’ADN avant la division cellulaire (durant la phase S du cycle cellulaire, le nombre de chromosomes double pendant la prophase de la mitose). Il utilisa pour ces expériences un spectrophotomètre équipé d’une optique en quartz (n’absorbant pas le rayonnement ultraviolet), ce qui lui permit de quantifier les acides nucléiques.

Les données sur la présence d’ADN et d’ARN dans le noyau furent confirmées par des analyses biochimiques sur des préparations de noyaux purifiées à partir d’une variété de tissus (foie, rein, thymus, rate cerveau, muscle). Les premières tentatives de purification remontaient au XIXe siècle (Friedrich Miescher, en 1869, Burton, en 1870). La difficulté de l’entreprise était de trouver le juste milieu entre deux exigences contradictoires : pousser suffisamment loin le processus de purification pour éviter la contamination des noyaux par du matériel cytoplasmique, et éviter des conditions expérimentales trop drastiques entraînant une perte de matériel nucléaire à travers une membrane endommagée. Martin Behrens, en 1932, utilisait la congélation rapide des tissus suivie de lyophilisation. La poudre obtenue était homogénéisée dans des solvants organiques et l’homogénat, fractionné dans un gradient de densité de solvants organiques. Les résultats furent décevants en partie à cause de l’effet destructeur des solvants organiques sur l’enveloppe nucléaire (solubilisation des phospholipides). Behrens abandonna ses travaux en 1938 mais ses conditions expérimentales furent reprises dans les années 1950 par Alfred E. Mirsky (Rockefeller Institue for Medical Research), G. Siebert ou Alexander L. Dounce (Department of Biochemistry and Pathology, University of Rochester). D’autres conditions d’homogénéisation furent essayées par Dounce, Vincent Allfrey (Rockefeller University), H. Stern : solutions d’acide citrique ou de saccharose, Warring Blender à couteaux d’acier, homogénéiseur en verre et piston en téflon, homogénéiseur en verre. En 1950, R. M. Schneider et A. L. Peterman montrèrent que la présence de cations divalents (calcium) dans le milieu d’homogénéisation préserve l’intégrité de l’enveloppe nucléaire et maintient son imperméabilité aux macromolécules. En 1960, Georgii P. Georgiev et J. S. Chentsov furent les premiers à pratiquer le contrôle de qualité des préparations de noyaux par examen au microscope électronique.

Rôle du noyau

Les cellules eucaryotes possèdent un ou plusieurs noyaux, à l’exception des globules rouges humains qui n’en ont pas. La destruction au laser de cet organite ou son extraction par micromanipulation entraînent la mort rapide de la cellule. Le bon fonctionnement du noyau est indispensable à la survie de la cellule ; il assure : (i) la ségrégation et le stockage du matériel génétique ; (ii) la duplication du matériel génétique avant la division cellulaire ; (iii) la copie du génome en ARN. Le noyau possède l’équipement enzymatique nécessaire à la réplication du matériel génétique et à son expression. L’expression du génome comporte deux phases : (i) une étape intranucléaire de transcription des gènes en ARN (ARNm, ARNt, ARNr et ARN de petite taille) ; (ii) une étape extranucléaire de traduction de l’ARNm et de synthèse des protéines par les ribosomes cytosoliques libres ou liés au réticulum endoplasmique. Les produits de traduction – protéines de structure et enzymes – assurent le fonctionnement, la différentiation, la division des cellules et leur adaptation aux variations de l’environnement. Les échanges entre nucléoplasme et cytoplasme se font à travers les pores de l’enveloppe nucléaire : les ARN et les ribonucléoprotéines (en premier lieu les sous-unités ribosomiales) migrent du noyau vers le cytoplasme, tandis que les ADN polymérases, ARN polymérases, protéines télomériques, histones et enzymes divers, synthétisées par les polysomes libres, migrent du cytosol vers le nucléoplasme. Chez les Ciliés, des êtres unicellulaires appartenant au groupe des protistes, les fonctions de stockage et de duplication du matériel génétique sont assurées par le micronucleus, et la synthèse des ARN se déroule dans le macronucleus. Chez les procaryotes, dépourvus de noyau, transcription et traduction se déroulent dans le compartiment cellulaire.

Aujourd’hui, personne ne songerait à mettre en doute le fait que le noyau, et non le cytoplasme, est le dépositaire du patrimoine génétique. Cela ne fut pas toujours le cas. Cette question fit l’objet d’interminables débats. Le botaniste Carl von Nägeli soutenait que « le transmetteur hypothétique des caractères héréditaires » était l’« idioplasme », une portion particulière du cytoplasme qu’il ne parvint jamais à définir avec précision. Dans les années 1760, au cours d’expériences d’hybridation avec diverses espèces de plants de tabac (Nicotiana rustica, Nicotiana paniculata), le botaniste Joseph G. Kölreuter avait conclu que l’ovule et le spermatozoïde contribuent de manière égale à la transmission des caractères héréditaires. Utilisant, comme le firent Oscar Hertwig ou Hermann Fol, l’argument des tailles respectives du cytoplasme de l’œuf et du spermatozoïde, il estimait que la transmission de l’hérédité ne pouvait pas incomber au cytoplasme ou, du moins, pas à sa totalité. Parmi un fatras de spéculations plus fantaisistes les unes que les autres, Ernst Haeckel, dans son ouvrage publié en 1866 « Allgemeine Anatomie », tranchait en faveur du noyau, une opinion que partageait et soutenait Wilhelm Roux, embryologiste à Université de Breslau. Eduard Strasburger apporta en faveur de cette thèse un argument expérimental tiré de l’observation de la fécondation l’orchidée Orchis latifolia : le tube pollinique parvient au contact du sac embryonnaire en se frayant un chemin à travers le pistil et il éjecte un noyau.

Pour trancher définitivement le débat, il fallait au moins connaître la localisation précise de l’ADN dans la cellule. En 1884 et 1885, Oskar Hertwig publia deux articles dans lesquels il pointait la nucléine comme matériel héréditaire. En 1929, Hans K.H.A. Lohman, Cyrus H. Fiske et Yellagaprada Subbarow (Harvard Medical School) découvrirent la présence dans le tissu musculaire d’un composé phosphoré : l’adénosine triphosphate (ATP). Son rôle dans la contraction musculaire fut découvert en 1934 par Lohman (Humbold Universität, Berlin), et son rôle dans les échanges énergétiques, par Otto H. Warburg, Fritz Meyerhof et Fritz A. Lipmann, en 1937 et 1938. L’ADN contenant un nucléotide apparenté à l’ATP, on lui attribua la fonction de réserve de nucléotides à usage énergétique pour les cellules. Il faut se souvenir que nous étions à la belle époque de l’hypothèse du « tétranucléotide ». L’ADN, avec seulement quatre bases différentes, semblait être une molécule bien trop simple pour servir de matériel génétique.

Un débat qui agita aussi les biologistes opposa les tenants de la division « directe » du noyau (il se divise par étranglement) proposée par Rudolf Virchow, A. Heller et Robert Remak, à ceux de la division « indirecte », avec partition longitudinale et migration des chromosomes. Wilhelm Roux opta pour la seconde option, en faisant valoir que le matériel nucléaire, tel qu’on peut l’observer au microscope, est réparti de manière hétérogène. Cette hétérogénéité compliquerait et même empêcherait une égale répartition quantitative et qualitative du matériel héréditaire.

Caractères héréditaires et facteurs particulaires

L’histoire de la découverte de Johan Mendel est connue. En bref, il entreprit en 1856 la culture de pois dans le jardin botanique de son monastère, à Brno en Autriche, et fit une étude statistique du mode de transmission d’une génération à la suivante des caractères organoleptiques « dominants » (graines lisses, graines de couleur jaune, etc…) et « récessifs » (graines ridées, graines de couleur verte, etc…). A la suite de ces travaux, il formula l’hypothèse que les caractères héréditaires sont déterminés par des « unités discrètes », des « facteurs particulaires », transmissibles individuellement des parents à leur descendance, en conservant leur intégrité. Il nota que les caractères récessifs disparaissent chez les hybrides de première génération mais réapparaissent chez les hybrides de seconde génération. Les lois de Mendel s’appliquaient à la répartition des caractères héréditaires chez les plantes. Bien plus tard, William Bateson et Lucien Cuénot montrèrent qu’elles s’appliquaient aussi au monde animal. A propos de la découverte Mendel, il est légitime de se poser deux questions : (i) pourquoi a-t-il réussi à établir clairement des lois là où tant d’autres avant lui avaient échoué ? Il n’était pas le premier à s’intéresser à la transmission des caractères organoleptiques chez les plantes ; dans les années 1760, Josef G. Kölreuter avait mené de nombreuses expériences d’hybridation avec Nicotiana. (ii) Pourquoi sa publication de 1865, « Versuche über Pflanzenhybriden », fut elle largement ignorée pendant plus d’un quart de siècle ?

A la première question, l’on peut répondre que le succès de Mendel tient en grande partie au choix judicieux, et en partie involontaire, du matériel expérimental : des variétés pures de pois, obtenues après une série d’autofécondations. Les descendants étaient semblables aux parents et ne variaient entre eux que par un nombre limité de caractères organoleptiques présents sous deux formes : graine lisse ou graine ridé, graine jaune ou graine verte, etc, ce qui permettait de suivre aisément le passage d’un caractère d’une génération à la suivante. En outre, un heureux hasard voulut que les gènes étudiés par Mendel étaient localisés sur des chromosomes différents. Enfin, à l’Université de Vienne, il avait acquis des connaissances en statistiques en suivant le cours du physicien et mathématicien Christian J. Doppler ; elles lui permirent de présenter ses résultats de manière analytique.

Il est plus difficile d’apporter une réponse claire à la seconde question. Mendel (Gregor en religion) présenta ses résultats en février et en mars 1865 aux membres d’une petite société locale, la Société d’histoire naturelle de Brünn, et publia en 1866 son mémoire (« Versuche über Pflanzen-Hybriden ») dans les Verhandlungen des Naturforschenden Vereines in Brünn. Il est plus que probable que les membres de la société n’aient pas compris pas l’importance de cette publication. Mendel envoya des copies du mémoire à des botanistes de renom parmi lesquels Carl W. von Nägeli, professeur de physiologie végétale à l’Université de Munich. Nägeli remercia Mendel par courrier et lui promit de procéder à une vérification expérimentale de ses conclusions. Et puis… plus rien. Ou bien Nägeli n’a jamais pris le temps de lire en détail le mémoire de Mendel ; ou bien le lut-il sans en comprendre la portée, ce qui semble assez stupéfiant pour un botaniste qui s’intéressait aussi au mode de transmission des caractères héréditaires ; ou bien choisit-il sciemment de ne pas assurer sa diffusion, ce qui serait une malhonnêteté intellectuelle. A l’appui de cette dernière opinion, il faut savoir qu’au moment où il reçut le mémoire de Mendel Nägeli rédigeait un ouvrage (paru en 1884) exposant sa fumeuse théorie mécanico-physiologique de l’évolution et son non moins fumeux concept sur le rôle de l’« idioplasme » dans la transmission des caractères héréditaires.

Les lois de Mendel sur la disjonction des caractères héréditaires furent redécouvertes 35 ans plus tard par Hugo Marie de Vries, professeur de botanique à l’Université d’Amsterdam. En 1859, le naturaliste Charles Darwin avait fait paraître chez l’éditeur John Murray, à Londres, son célèbre ouvrage « On the origin of species by means of natural selection, or preservation of favoured races in the struggle for life ». Pour Darwin, l’évolution était un phénomène lent, graduel, progressif : « la nature ne fait pas de sauts », avait-il coutume de dire. Ce n’est pas tout à fait exact… elle en fait parfois, comme allait le montrer de Vries avec la découverte des « mutations ».

Comme Mendel, de Vries fit le choix du bon matériel expérimental : l’œnothère à grandes fleurs ou œnothère de Lamarck (Enothera lamarckiana). Parmi les milliers de plants de primevère mis en culture, il observa l’apparition d’un petit nombre d’individus (moins de 1/1.000) dont les caractères organoleptiques étaient différents de ceux de leurs parents : des plantes naines ou à grandes feuilles. Ces individus, mis en culture, transmettaient les nouveaux caractères à leur descendance. De Vries aboutit à la conclusion que, lors du passage d’une génération à la suivante, des variations brusques affectent la transmission à la descendance de particules élémentaires d’hérédité. Dans l’ouvrage qu’il publia en 1889 : « Intracellulare Pangenesis », il appela ces particules élémentaires des « pangènes » et donna à ces changements le nom de « mutations ». Il proposa une vision de l’évolution faisant intervenir ces brusques variations dans « Die Mutationstheorie » qui parut au début du XXe siècle. Les résultats de ses travaux sur l’hérédité des plantes (œnothère, Lychnis, Solanum, Datura, Chélidoine, Pavot, …), entrepris en 1880, firent l’objet de deux articles publiés en 1900 : le premier, en français : « Sur la loi de disjonction des hybrides », ne comportait pas de référence à la publication de Mendel. Cette omission fut corrigée dans le second article, en allemand : « Das Spallungsgezetz der Bastarde ». Ce comportement vertueux fut peut être inspiré à De Vries par la lecture de l’article du botaniste Carl F.J.E. Correns (Universität Tübingen) paru en 1900 : « G. Mendel’s Regel über das Verhalten der Nachkommenschaft der Rassenbastarde ». Le nom du découvreur des lois de l’hérédité figurait dans le titre. Il faut dire que lorsqu’il était étudiant à Munich, le mentor de Correns était Carl W. von Nägeli qui avait reçu une copie du mémoire du moine de Brno. En a-t-il fait part à son élève ? Enfin, un troisième botaniste, Erich von Tschermak-Seysenegg, cita la publication de Mendel dans sa thèse de doctorat soutenue à l’Université de Vienne en 1900. Son grand-père, l’illustre botaniste Eduard Fenzl, avait eu Johan Mendel comme étudiant.


Facteurs particulaires et chromosomes

« … de ces recherches,… il découle au moins un résultat certain, et ce résultat, c’est l’existence d’une substance héréditaire, d’un véhicule matériel des tendances héréditaires, et le fait que cette substance est contenue dans le noyau de la cellule germinative et dans cette partie du filament nucléaire qui, à certains moments, revêt la forme d’anses ou de baguettes courtes. »

Auguste Weismann

Friedrich L. A. Weissman, professeur de zoologie à l’Université de Fribourg, est considéré comme l’évolutionniste le plus important du XIXe siècle après Charles Darwin. Plus théoricien qu’expérimentateur, Weissman porta un grand intérêt aux différences entre cellules germinales et cellules somatiques. En 1892, il fit oeuvre de visionnaire en avançant des hypothèses qui allaient se révéler exactes : noyaux et chromosomes joueraient un rôle majeur dans la transmission de l’hérédité ; les caractères héréditaires seraient répartis linéairement le long des chromosomes ; lors de la fécondation apparaîtraient de nouvelles combinaisons de chromosomes et donc de caractères héréditaires. La preuve expérimentale fut apportée par les résultats obtenus par un brillant étudiant en médecine : Walter S. Sutton. En 1903, il établir un lien entre les lois de Mendel et l’hypothèse chromosomique de l’hérédité en montrant qu’il existe des similitudes entre le comportement des chromosomes au cours de la division cellulaire et celui des facteurs mendéliens de l’hérédité.

Le zoologiste C.E. McClung (Kansas University) utilisait comme matériel expérimental des sauterelles ; ces insectes ont des spermatogonies de grande taille, faciles à observer au microscope optique ; les chromosomes, visibles lors de la division cellulaire, sont facilement reconnaissables individuellement. A partir de ce matériel, McClung identifia un chromosome présent dans la moitié seulement des cellules germinales ; il en déduisit que ce chromosome devait déterminer le sexe et publia, en 1902, un article intitulé « The accessory chromosome-sex déterminant ». C’était la première fois qu’un lien était établi entre un chromosome et un caractère phénotypique. En 1898, Walter Sutton entreprit sa thèse de doctorat sous la direction de McClung, sur la formation des gamètes chez la sauterelle Brachystola magna. Dans l’épithélium séminifère, les spermatogonies (diploïdes) se transforment successivement en spermatocytes, spermatides et spermatozoïdes (haploïdes). Brachystola possède onze chromosomes morphologiquement différents, dont le chromosome accessoire de McClung. Ces différences de morphologie traduisaient des différences qualitatives entre les chromosomes. Sutton poursuivit son travail dans le laboratoire du zoologiste et généticien Edmund B. Wilson (Columbia University) où il reçut une leçon de mendélisme de la part de William Bateson (John Innes Institute, London) de passage à New York en 1902. Surnommé « The great prophet of Mendelism », Bateson avait traduit en anglais la publication de Mendel et s’était fait le propagandiste de la théorie mendélienne de l’hérédité au cours de conférences et de tournées des laboratoires. Le travail de Sutton aboutit en 1903 à la publication de « The chromosomes in heredity », un « classique » de la génétique. Il mettait en évidence les analogies de comportement entre chromosomes et facteurs particulaires de Mendel (que Sutton appelait « gènes ») ; les uns comme les autres gardent leur intégrité à travers les divisions cellulaires et se répartissent de manière indépendante dans les cellules filles. Il avança l’idée que les facteurs particulaires sont localisés sur les chromosomes ; que la répartition des chromosomes parentaux entre les cellules germinales, leur association par paires et leur séparation au cours de la réduction chromatique corroborent les conceptions mendéliennes sur la ségrégation des caractères héréditaires ; elles seraient l’expression physique de la manière dont se répartissent les gènes entre cellules filles.

Ses travaux sur la méïose dans les cellules germinales font de Sutton le pionnier de la cytogénétique, une branche de la biologie appelée à un grand développement au cours du XXe siècle. Alors qu’il semblait promis à une brillante carrière universitaire, Sutton abandonna la recherche pour se lancer dans la prospection pétrolière, avant de devenir chirurgien à Kansas City. On ne peut que le regretter. Sa théorie chromosomique de l’hérédité était prémonitoire et rejoignait celle formulée par Theodor Boveri à la suite de ses travaux sur l’embryogenèse de l’œuf d’oursin. Pourtant, l’accueil dans les milieux scientifiques de ce que l’on a appelé la théorie chromosomique de Sutton-Bovery fut mitigé et même sceptique ; faisant preuve d’un surprenant manque de clairvoyance, le mendélien William Bateson et Thomas Hunt Morgan furent parmi ceux qui la rejetèrent le plus catégoriquement.


Les erreurs innées du métabolisme

Archibald E. Garrod était un brillant clinicien : il accomplit une œuvre remarquable en établissant le lien entre facteurs mendéliens (les gènes) et enzymes. Garrod n’était pas destiné à devenir médecin comme son père ; celui-ci souhaitait le voir faire carrière dans les affaires mais devant les aptitudes intellectuelles du jeune étudiant ses maîtres l’orientèrent vers la faculté de médecine de l’Université d’Oxford. Garrod père s’était distingué dans l’étude de la goutte en utilisant une approche chimique pour comprendre le mécanisme d’accumulation l’accumulation d’acide urique dans les articulations. Garrod fils lui emboîtât le pas en s’intéressant à une maladie héréditaire au cours de laquelle l’urine des patients, exposée à l’air, prend une coloration rouge foncé. Les sujets développent une forme d’arthrite invalidante et sont atteints d’une anomalie métabolique impliquant un acide aminé : chez le sujet normal, le catabolisme de la tyrosine s’accompagne de la formation d’alcaptone ou acide homogentisique. Chez les patients, ce catabolite est produit à un taux anormalement élevé et passe du sang dans l’urine des patients ; son oxydation est responsable de la coloration des urines. Garrod collecta les urines des patients et des membres de leur entourage, nota soigneusement leurs caractères organoleptiques et se livra à des enquêtes familiales (on parlerait aujourd’hui d’enquêtes épidémiologiques). En 1902, il publia un article dans The Lancet sous le titre « The Incidence of Alkaptonuria : A Study in Chemical Individuality ». En adepte du Mendélisme, converti par William Bateson, Garrod concluait que l’alcaptonurie est une maladie héréditaire récessive dans laquelle un enzyme du métabolisme de la tyrosine est défectueux. La maladie affecte les individus homozygotes pour l’allèle (récessif) du gène. Trop audacieuse pour l’époque, cette hypothèse ne rencontra que peu d’échos dans la communauté scientifique. Loin de se décourager, Archibald Garrod étudia d’autres maladies métaboliques héréditaires, comme la cystinurie, la pentosurie, et l’albinisme. Dans son ouvrage « Inborn errors of metabolism », publié en 1923, il définit un champ nouveau de la pathologie : celui des erreurs innées du métabolisme. Il formula l’hypothèse que les gènes ont un impact biochimique en contrôlant l’activité des enzymes. La mutation d’un gène peut entraîner l’inactivation ou l’absence de l’enzyme codé par ce gène, ou l’altération de son fonctionnement normal.


Thomas H. Morgan et Drosophylla : Naissance de la biologie expérimentale

Au début de sa carrière universitaire, Thomas Hunt Morgan était un mutationniste dans la ligne d’Hugo de Vries. Les idées du célèbre botaniste, re-découvreur en 1900 des lois de Mendel, allaient dans le sens de la théorie de l’évolution en offrant une explication à l’apparition de nouvelles espèces. Par contre, Morgan affichait un certain scepticisme vis à vis de la théorie mendélienne sur la transmission des caractères héréditaires et à fortiori, comme je l’ai dit plus haut, dans la théorie chromosomique de Sutton-Bovery. C’est donc dans un esprit critique qu’il décida d’examiner les conclusions d’Archibald Garrod sur la relation supposée entre gènes et enzymes.

A la base du succès de Morgan, il y a le choix d’un matériel expérimental simple, particulièrement bien adaptée à l’établissement de corrélations entre caractères phénotypiques et gènes : la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster. Ce minuscule insecte avait déjà fait son entrée dans la panoplie expérimentale du généticien sous l’égide de l’entomologiste Charles W. Woodworth (Harvard University). Drosophila a un génome de taille modeste réparti sur quatre chromosomes ; son cycle de reproduction est de dix jours, sa descendance est nombreuse et son élevage au laboratoire peu coûteux : des bananes écrasées en guise de nourriture, des bouteilles de lait vides en guise de cages. On raconte que les bouteilles de lait déposées devant le porche des maisons se trouvant sur le trajet des Morgan Raiders – c’est ainsi que furent baptisés les collaborateurs de Morgan : Alfred Sturtevant, Hermann Muller et Calvin Bridges – avaient une fâcheuse tendance à disparaître. Autre avantage de Drosophila comme matériel expérimental : la présence dans les glandes salivaires de chromosomes polytènes géants qui, après coloration, montrent sur toute leur longueur une succession de bandes sombres visibles au microscope. La perte d’un gène – un phénomène appelé « délétion » – se traduit par la disparition d’une bande correspondant à la position du gène sur le chromosome. Enfin, chez la drosophile mâle, la méiose se fait sans échange de matériel génétique entre chromosomes, une particularité que Morgan ignorait mais qui lui facilita considérablement l’interprétation des résultats.

Drosophila melanogaster a, comme son nom l’indique, un ventre (gâster) noir (melanos) et des yeux rouges. La découverte, en 1910, d’un mutant aux yeux blancs fut le point de départ d’une étude systématique des mutations affectant la couleur de l’œil. En croisant un mâle aux yeux blancs avec une femelle aux yeux rouges, Morgan établit que le caractère muté « yeux blancs » est récessif et le caractère sauvage « yeux rouges », dominant. Le croisement de femelles « yeux blancs » avec des mâles yeux rouges donnait naissance à des descendants dont seuls les mâles avaient les yeux blancs. Cette observation suggérait une relation entre le phénotype « couleur de l’œil » et le sexe de la mouche. En supposant l’existence d’un gène « white », Morgan établit une règle selon laquelle les gènes sont nommés d’après le phénotype des allèles mutants. Dans la « pièce des mouches » du laboratoire de Columbia University où Morgan, à l’invitation d’Edmund B. Wilson, occupait la chaire de zoologie expérimentale, les travaux avancèrent à un rythme soutenu. La transmission des caractères phénotypiques de milliers de Drosophila fut examinée en détail. Plus de 85 mutations furent localisées sur le chromosome sexuel.

En 1910, Morgan avait expérimentalement établi que les caractères phénotypiques sont déterminés par les gènes (les facteurs mendéliens) ; que les gènes sont localisés sur les chromosomes (ce que Walter Sutton avait déjà montré chez la sauterelle) ; que chaque chromosome contient un groupe déterminé de gènes. Morgan formula l’hypothèse que les gènes sont alignés linéairement sur les chromosomes comme les grains d’un chapelet, selon un ordre immuable. Après avoir mis au point la recombinaison chromosomique, une méthode permettant de déterminer la position d’un gène sur un chromosome, Morgan et Sturtevant établirent des cartes génétiques donnant la position de chaque gène étudié sur son chromosome. Ils calculèrent la distance séparant deux gènes contigus à partir des fréquences de recombinaison. Finalement, la position de centaines de gènes put être déterminée sur chacun des quatre chromosomes de la mouche du vinaigre. En 1912, Morgan publia les bases expérimentales de la théorie chromosomique formulée par Sutton et Boveri dans Journal of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia. Son ouvrage « The mechanism of mendelian heredity » paru en 1915 consacra l’avènement du gène comme unité fondamentale et indivisible de l’hérédité. Archibald Garrod avait établi une relation entre gène et enzyme par déduction logique ; Morgan démontra cette relation à partir de données expérimentales.


Beadle et Tatum : « One gene one enzyme »

Plus de trois décennies après la publication d’Archibald Garrod, « The Incidence of Alkaptonuria », le généticien George W. Beadle, un élève de Thomas H. Morgan, et le microbiologiste Edward L. Tatum apportèrent une confirmation expérimentale de l’hypothèse de Garrod sur la relation entre gènes et enzymes. La moisissure Neurospora crassa est un champignon microscopique aux exigences nutritives modestes ; pour synthétiser ses constituants polysaccharidiques, protéiques, et nucléiques, la « souche sauvage » – dite « souche prototrophe » – se contente d’un milieu contenant du glucose comme source de carbone, du chlorure d’ammonium comme source d’azote, d’une vitamine et de quelques minéraux. Le cycle vital de Neurospora est haploïde, ce qui facilite considérablement l’analyse génétique ; il n’y a pas de second allèle susceptible de masquer les effets de l’expression ou de la mutation d’un gène récessif.

Hermann Müller, collaborateur de Thomas Morgan, avait montré en 1926 que l’irradiation de Drosophila par des rayons X provoque l’apparition de nombreuses mutations. Cette découverte changea le cours des travaux en génétique ; au lieu d’attendre l’apparition de mutations spontanées, ce qui peut prendre beaucoup de temps, l’utilisation de l’irradiation par les rayons X permit d’accélérer considérablement le processus. Beadle et Tatum irradièrent une culture de Neurospora. Parmi les mutations apparues au hasard dans le génome, certaines se traduisirent par la perte de la capacité à synthétiser un métabolite essentiel : un acide aminé (par exemple, l’arginine) ou une vitamine (par exemple, la biotine). L’irradiation avait eu pour conséquence d’altérer ou de supprimer le fonctionnement d’enzymes de la voie biosynthétique de l’arginine ou de la biotine. Les mutants isolés furent qualifiés de « mutants auxotrophes » car, à la différence de la souche prototrophe, ils avaient perdu la capacité de pousser en « milieu minimum ». Pour relancer la croissance du mutant auxotrophe, il fallait ajouter au milieu de culture le métabolite manquant. Pour chaque mutant, Beadle et Tatum caractérisèrent le métabolite manquant, ce qui leur permit de remonter jusqu’à l’enzyme affecté par la mutation. L’article publié en 1941 : « Genetic control of biochemical reactions in Neurospora. » contribua à établir la notoriété de Beadle et Tatum, de même que la formule lapidaire : « One gene one enzyme ». Il ne fallut que 17 ans aux membres du jury Nobel pour apprécier l’importance de leur contribution scientifique et leur décerner le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1958.


Protéine ou ADN ? Nature du matériel génétique

« … in contrast to the popular conception supported by newspapers and mothers of scientists, a goodly number of scientists are not only narrow-minded and dull, but also just stupid. »

James D. Watson

Le pneumocoque (Streptococcus pneumoniae) fut dans le passé responsable de nombreuses et graves épidémies de pneumonie. Cette bactérie est entourée d’une capsule de polysaccharides mais il existe un mutant sans capsule qui est dénué de pouvoir pathogène. Dans les années 1920, alors qu’il travaillait pour le Ministère de la santé à Londres, le médecin Frederick Griffith essayait de développer un vaccin contre la pneumonie à pneumocoques. Au cours d’essais d’inoculation à des souris des bactéries inactivées par la chaleur, il injecta un mélange de mutant sans capsule et de bactéries rendues non pathogènes par chauffage. Contrairement au résultat attendu, les souris développèrent une pneumonie mortelle et les résultats de l’autopsie montrèrent que les tissus renfermaient la forme encapsulée de la bactérie. Un « principe transformant » avait changé le mutant non pathogène en pneumocoque pathogène. Ce résultat ne manqua pas de susciter des objections de la part de la communauté scientifique qui avança entre autres comme explication que la préparation de mutants était contaminée par des bactéries virulentes.

Ces critiques ne découragèrent pas Oswald Th. Avery (Rockefeller Institute for Medical Research) ; il croyait à l’hypothèse sur la « transformation » formulée par Griffith et au passage de « caractères » d’une souche bactérienne à l’autre. Avec ses collaborateurs, il entreprit un laborieux travail de purification du principe transformant. Dès 1933, James Lionel Alloway était parvenu à le solubiliser et à l’isoler partiellement. Avery poursuivit le travail de purification avec Colin Mac Leod et Maclyn McCarthy. Après des années de labeur, ils publièrent leurs résultats en 1944 dans le Journal of Experimental Medicine sous le titre « Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types : Induction of transformation by a deoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus Type III » (Avery avait alors soixante-sept ans). Avery, Mac Leod et McCarthy concluaient que le facteur transformant était l’ADN ! Malgré le nombre impressionnant de tests physiques, chimiques et enzymatiques auxquels le produit isolé fut soumis pour confirmer son identité, les incrédules n’en furent pas désarmés pour autant, prétendant que le principe transformant n’était pas de l’ADN mais des protéines contaminant la préparation. Depuis la découverte de la protamine par Friedrich Miescher, puis de l’histone par Albrecht Kossel, nombre de scientifiques étaient convaincus que les protéines basiques associées à la nucléine (et leurs vingt acides aminés) constituaient le matériel génétique et non pas les acides nucléiques et leurs quatre bases.

Pourtant d’autres arguments furent avancés en faveur de l’ADN : en 1948, André Boivin (Université de Strasbourg) et ses deux étudiants, Roger et Colette Vendrely, montrèrent que les noyaux des cellules somatiques d’un individu contiennent tous la même quantité d’ADN ; que dans chaque espèce, la quantité d’ADN par noyau est constante et en relation directe avec le nombre de chromosomes ; que les cellules haploïdes, spermatozoïdes et ovules, contiennent une quantité d’ADN équivalente à la moitié de celle présente dans les cellules somatiques. Ils publièrent leurs résultats dans les Compte-rendus hebdomadaires des scéances de l’Académie des Sciences : « L’acide désoxyribonucléique du noyau cellulaire, dépositaire des caractères héréditaires; arguments d’ordre analytiques » et dans Experientia : « La teneur du noyau cellulaire en acide désoxyribonucléique à travers les organes, les individus et les espèces animales ». Ces articles, rédigés en français, n’eurent pas la diffusion qu’ils méritaient.

Les milieux scientifiques finirent par se laisser convaincre par le résultat des expériences d’Alfred D. Hershey et de Martha Chase (Genetics Research Unit, Carnegie Institution at Cold Spring Harbor). Le bactériophage T2 est un phage lytique formé d’ADN et de protéines. Il pénètre dans Escherichia Coli en perçant la paroi de la bactérie. La tête du phage, constituée de protéines, reste à l’extérieur ; seul l’ADN est injecté dans le bactérioplasme. La machinerie de synthèse protéique de Coli fabrique les protéines du phage au détriment de celles de la bactérie et produit des virions. Leur accumulation fait éclater la paroi bactérienne et les phages libérés infectent d’autres bactéries. Pour savoir si l’information nécessaire à la fabrication des protéines virales est transférée à Coli par une protéine du phage ou par son acide nucléique, Hershey et Chase utilisèrent des radio-isototopes pour marquer les résidus méthionine ou cystéine des protéines du phage avec du soufre 35S et les résidus phosphate de l’ADN du phage avec du 32P. Les bactéries furent infectées avec des phages marqués soit au 35S, soit au 32P. Après infection, les phages furent détachés des bactéries par un traitement mécanique et le milieu d’incubation fut centrifugé de façon à sépare un culot de bactéries infectées et un surnageant contenant les phages. La radioactivité due au marquage par le 35S (protéines) se trouvait surtout dans le surnageant et celle due au marquage par le 32P (ADN), surtout dans le culot mais la séparation entre les deux marqueurs fut loin d’être totale.

Ces résultats furent publiés en 1952 dans The Journal of General Physiology dans un article intitulé : « Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage ». La communauté scientifique qui s’était montrée si tatillonne et si critique vis à vis des résultats d’Oswald Avery avala sans broncher ceux de Hershey et Chase. Les temps avaient changé ; l’ADN était à la mode. Pourtant Hershey et Chase ne firent que confirmer de manière plutôt moins convaincante ceux d’Avery publiés dix ans plus tôt. Il est vrai qu’Alfred Hershey était, avec Max Delbrück et Salvador Luria, un membre du Groupe du phage qui jouissait, dans la communauté scientifique, d’un immense prestige que beaucoup estiment aujourd’hui surévalué. Alfred Hershey, Max Delbrück et Salvador Luria partagèrent le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1969.

La règle de Chargaff

Erwin Chargaff (Department of Biochemistry, Columbia University) crut d’emblée à la pertinence des résultats d’Oswald Avery (ils n’étaient pas nombreux dans ce cas). Si l’ADN était bien le dépositaire du patrimoine génétique, il semblait exister une disproportion entre la diversité du monde vivant et la simplicité d’une séquence tétranucléotidique répétitive telle que l’avait définie Phoebus Levene. Chargaff décida de soumettre à l’épreuve le modèle du tétranucléotide en mesurant la teneur en bases d’acides désoxyribonucléiques de différentes sources. Le chimiste Aaron Bendich lui suggéra d’utiliser la chromatographie de partage introduite en 1941 par Archer J.P. Martin (National Institute for Medical Research, London) et Richard L.M. Synge (Roswett Research Institute, Bucksburn, Scotland) pour séparer les acides aminés. Chargaff l’adapta à la séparation des bases puriques et pyrimidiques et Ernst Vischer mit au point une méthode de quantification des bases par spectrophotométrie dans l’ultraviolet. Les résultats furent à la hauteur des efforts techniques consentis : les proportions molaires des bases étaient variables selon les tissus analysés, un résultat qui était en contradiction avec le modèle du tétranucléotide. Pour tous les ADN testés, la teneur en adénine (A) était sensiblement égale à la teneur en thymine (T) et la teneur en guanine (G) égale à celle en cytosine (C) :

% A = % T

% G = % C

Dans l’ADN humain, Chargaff calcula qu’il y avait environ 30% de chacune des bases puriques (A, T) et 20% de chacune des bases pyrimidiques (G, C). Les valeurs exactes étaient : A = 30.9%, T = 29.4%, G = 19.9% et C = 19.8%. Ces résultats furent publiés en 1950 par Erwin Chargaff, Stephen Zamenhof et Charlotte Green dans la revue Nature : « Composition of human desoxypentose nucleic acid ». Il est surprenant de constater que leur importance ne fut pas perçue par la communauté des scientifiques qui continuait à s’interroger sur la nature du matériel gènétique. Cinq ans après la publication de l’article de Chargaff, le généticien James D. Watson, un élève de Salvador Luria (Indiana University), allait en réaliser l’importance.

Le matin des physiciens

« All we have to do was to construct a set of molecular models and begin to play… »

James D. Watson

La cristallographie par rayons X est un outil puissant qui permet d’établir la répartition spatiale des atomes d’un cristal. Les rayons X utilisés en cristallographie ont une longueur d’onde proche de la distance des liaisons interatomiques dans les macromolécules biologiques : de 0,05 à 0,15 nanomètre. En 1912, le physicien Max T.F. von Laue, ancien assistant de Max Planck et grand ami d’Albert Einstein, eut l’idée d’envoyer un faisceau de rayons X à travers un cristal. La rencontre avec les centres atomiques du réseau produisit des interférences et la formation d’une image de diffraction caractéristique. En 1914, von Laue reçut le prix Nobel de physique « pour sa découverte de la diffraction des rayons X par des cristaux ». William Henry Bragg et William Lawrence Bragg (Cambridge University, prix Nobel de physique en 1915) adaptèrent la technique à l’analyse de cristaux de substances minérales. Les métallurgistes l’adoptèrent pour déterminer les caractéristiques d’alliages comme l’acier, et les minéralogistes, pour établir l’architecture de substances cristallines. L’étude des macromolécules biologiques commença dans les années 1920 et celle des protéines, dans les années 1930 dans les laboratoires de John Desmond Bernal (Birbeck College Laboratory), et de William T. Astbury (Leeds University).

La cristallographie par rayons X consiste à bombarder une cible avec un faisceau incident de rayons X très énergétiques produits par « bouffées » dans des accélérateurs de particules élémentaires appelés synchrocyclotrons (aujourd’hui, dans des synchrotrons dits de troisième génération). Comme il n’existe pas de lentilles capables de concentrer les rayons X, le faisceau diffracté ne donne pas d’image de l’échantillon étudié. Il faut recourir à une lentille virtuelle constituée d’un détecteur électronique relié à un ordinateur. L’image tridimensionnelle de l’échantillon est reconstituée par traitement mathématique des données. Dans les premiers appareils, le faisceau diffracté produisait des centaines, voire des milliers de taches sur un film photographique. La position et l’intensité de chaque tache étaient analysées et mesurées par le procédé mathématique des transformées de Fourrier et la carte de densité électronique ainsi obtenue était interprétée le plus exactement possible. L’étude théorique permettant cette interprétation fut réalisée par Henry et Lawrence Bragg et par Linus C. Pauling (prix Nobel de chimie en 1954).

Le préalable à toute étude cristallographique est l’obtention d’une structure régulière et ordonnée : des cristaux (idéalement) ou des fibres orientées dans le même sens. Dans les années 1930, William T. Astbury (Leeds University) étudia la structure du collagène et des kératines, des protéines fibreuses constitutives des cheveux, de la laine et de la soie. Il utilisa, pour interpréter ses résultats, les données publiées par Linus C. Pauling et Robert Corey sur la structure tridimensionnelle de la liaison peptidique. A leur tour, Pauling et Corey s’inspirèrent de la structure de la kératine publiée par Astbury en 1947 pour déterminer celle de l’hélice α, la première structure protéique secondaire connue. Les premières tentatives pour obtenir des cristaux de protéines datent des années 1920. Vers la fin de la décennie, des cristaux d’hémoglobine et d’uréase de bonne qualité étaient à la disposition des physiciens. En 1937, Max F. Perutz (Cavendish Laboratory, University of Cambridge) entreprit l’analyse aux rayons X de cristaux d’hémoglobine de cheval, la protéine transportant l’oxygène dans le sang des mammifères. De 1958 à 1960, Perutz détermina la structure tridimensionnelle de l’hémoglobine, et John C. Kendrew, celle de la myoglobine (153 résidus d’acides aminés, 26.000 atomes), la protéine transportant l’oxygène dans les muscles. Leurs résultats montrèrent que chaque protéine possède une structure dimensionnelle et une conformation uniques. Cette conclusion fut confirmée en 1965 par les données de David Chilton Phillips et ses collègues (Davy Faraday Research Laboratories, Royal Institution, Londres) sur le lysozyme, une protéine du blanc d’œuf.

Après l’étude des protéines fibreuses, William Astbury aborda en 1937 l’analyse cristallographique de longues fibres d’ADN fournies par Rudolf Signer et Torbjörn Caspersson. Les clichés de diffraction obtenus révélaient que l’ADN, comme les protéines, possède une structure régulière. Astbury confirma la prédiction d’Hammarsten et Signer : le plan des bases est perpendiculaire au grand axe de la molécule d’ADN et calcula la distance séparant deux bases voisines : 0,34 nanomètre, une valeur très proche de la valeur réelle dans la forme B de l’ADN. A partir de ses données rudimentaires, Astbury proposa un modèle d’ADN monocaténaire dont s’inspirera Linus Pauling pour proposer, en 1953, son modèle (erroné) d’ADN en triple hélice publié dans les Proceedings of the National Academy of Sciences.

En 1951, les physiciens du King’s College, à Londres, Maurice Wilkins et Rosalind Franklin s’intéressèrent à leur tour à l’ADN. Franklin avait une bonne pratique de l’analyse aux rayons X acquise et dans le laboratoire de John D. Bernal, puis au cours d’un séjour à Paris. Je rappelle que c’est dans le groupe de Bernal qu’avait été établie la configuration spatiale des nucléotides, avec le plan du pentose perpendiculaire à celui de la base, une information qui se révèlera essentielle pour le modèle de structure de Watson et Crick. Rudolf Signer avait donné à Franklin un sel de sodium de l’ADN, à partir duquel Wilkins avait obtenu un précipité de fibres uniformément orientées. Elle obtint des clichés de diffraction (des formes dite A et B) qui révélaient la nature hélicoïdale de l’ADN. En 1950, James Watson et Francis Crick (Cavendish Laboratory, University of Cambridge) essayèrent de reconstituer la structure tridimensionnelle de l’ADN en construisant des modèles, entrant ainsi en compétition avec Wilkins et Franklin, mais aussi avec Linus Pauling (Californian Institue of Technology). Dans son ouvrage [4] paru en 1968, Watson a décrit les circonstances un peu troubles de la découverte de la structure en double hélice [5]. Watson et Crick parvinrent à la solution du problème sans avoir fait une seule expérience de diffraction aux rayons X ; ils se contentèrent de jeter un coup d’œil sur les clichés de diffraction obtenus par Franklin et montrés par Wilkins en l’absence de l’intéressée. Ils construisirent un modèle intégrant le diamètre estimé de l’hélice (2 nanomètres), les informations fournies par le physico-chimiste Jerry Donohue sur les formes tautomériques des bases (la « bonne forme » est la forme céto) et la Règle de Chargaff sur l’équivalence des proportions des bases A/T (adénine-thymine) et G/C (guanine-cytosine).

La reconstitution de la structure tridimensionnelle d’une molécule par construction d’un modèle physique avait été imaginée en 1928 par le chimiste Kurt Meyer (Herman Mark I.G. Farben, Ludwigshafen) pour la structure tridimensionnelle de la cellulose et de la fibroïne de la soie. Ces deux macromolécules fibrillaires présentent suffisamment d’éléments de régularité pour donner des diagrammes de diffraction interprétables. A partir du modèle physique qu’il avait élaboré, Meyer calcula les coordonnées théoriques de diffraction et les compara aux valeurs obtenues à partir de clichés cristallographiques. La « folle poursuite », pour paraphraser le titre de l’ouvrage de Francis Crick paru en 1988 : « What Mad Pursuit. A personal View of Scientific Discovery » s’acheva avec la publication [6], en 1953, du modèle en double hélice : l’ADN est formé de deux chaînes poly-désoxyribonucléotidiques enroulées en double hélice droite ; les groupes phosphate (chargés) sont dirigés vers l’extérieur et les bases (hydrophobes) vers l’intérieur de l’hélice. Les bases d’une des deux chaînes sont liées par des liaisons hydrogène aux bases complémentaires de l’autre chaîne : A avec T (par deux liaisons) et G avec C (par trois liaisons). La stabilité de la molécule est assurée par l’environnement hydrophobe créé au centre de l’hélice par les bases et par les groupes phosphates dont les charges négatives sont dirigées vers l’extérieur (dans le modèle publié en 1953 par Linus Pauling, les groupes phosphate étaient dirigés vers l’intérieur de la triple hélice et les bases, vers l’extérieur). James Watson, Francis Crick et Maurice Wilkins partagèrent le prix Nobel de médecine ou physiologie en 1962.

Réplication

« It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests copying mechanism for the genetic material. »

James D. Watson & Francis H. Crick

La réplication du matériel génétique est l’une des fonctions les plus importantes du noyau. Au début de la division cellulaire les chromosomes se dédoublent et chaque cellule-fille reçoit le même nombre de chromosomes que la cellule-mère (sauf dans le cas de la méiose). Le dédoublement des chromosomes s’accompagne d’une synthèse d’ADN pendant la phase S (Synthèse) du cycle cellulaire. Plusieurs mécanismes de réplication de la molécule d’ADN étaient envisageables. Le modèle en double hélice de l’ADN montrait qu’une séquence de bases précise est nécessaire pour maintenir et perpétuer la structure hélicoïdale. Partant de cette constatation, Crick et Watson proposèrent un modèle de réplication du matériel génétique. Dans un article [7] de 1953, Crick et Watson suggérèrent un mécanisme dit semi-conservatif implique que les deux brins d’ADN se séparent et servent de matrice pour le recrutement et l’association de nucléotides complémentaires, conduisant à l’assemblage des deux brins d’une nouvelle chaîne polynucléotidique. Le choix des nucléotides est dicté par la séquence des bases du brin servant de matrice. Si ce modèle est correct, toute molécule d’ADN néo-synthétisé devrait être constitué d’un brin d’ADN-matrice et d’un brin néoformé. Différentes approches expérimentales furent mises en œuvre pour le démontrer.

En 1956 et 1957, J. Herbert Taylor (Department of Biological Science, The Florida State University) mit à l’épreuve le modèle semi-conservatif de Crick et Watson. Il cultiva des graines de haricots (Vicia faba) dans un milieu contenant les quatre nucléotides entrant dans la composition de l’ADN, dont un seul – la thymidine – était marqué au tritium 3H. Pour observer les chromatides filles après duplication de l’ADN chromosomique marqué au 3H, il transféra les cellules dans un milieu de culture contenant des nucléotides non marqués et de la colchicine. Cet alcaloïde extrait de la pervenche (Vinca minor) se fixe spécifiquement sur les protéines des microtubules du fuseau mitotique, bloquant la migration des chromatides vers les pôles et empêchant la séparation des cellules filles. Les chromosomes étant arrêtés à la métaphase, Herbert put observer la répartition du marquage au 3H sur les chromatides sœurs appariées.

En 1957, Matthew S. Meselson et Franklin W. Stahl (Californian Institue of Technology) firent croître la bactérie Escherichia coli dans un milieu nutritif avec, comme source d’azote, du chlorure d’ammonium marqué avec l’isotope « lourd » 15N de l’azote. Les bactéries furent transférées dans un milieu contenant l’isotope stable naturel 14N. Un échantillon de milieu fut prélevé à intervalles réguliers, l’ADN extrait et sa masse déterminée par centrifugation à grande vitesse dans un gradient de densité de chlorure de césium. Les molécules d’ADN atteignaient leur position d’équilibre isopycnique dans le gradient, repérable par lecture optique à la longueur d’onde d’absorption de l’ADN dans l’ultraviolet. Les clichés photographiques montraient les changements de position de la bande d’ADN. En fonction du temps d’incubation des bactéries dans le milieu contenant 15N apparaissait d’abord une bande « lourde » d’ADN 15N, puis une bande plus légère d’ADN hybride 15N-14N), puis une bande légère d’ADN 14N au-dessus de la bande lourde et de la bande hybride.

En 1963, John F. Cairns (John Curtin School of Medical Research, Australia et Cold Spring Laboratory) réalisa une spectaculaire expérience combinant autoradiographie et microscopie électronique pour montrer de visu la réplication semi-conservative de l’ADN du chromosome circulaire d’Escherichia Coli.

La réplication de l’ADN est catalysée par les ADN polymérases ADN-dépendantes, des complexes multienzymatiques présents dans le noyau. Les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes de levure possèdent trois polymérases numérotées I, II et III, dans l’ordre de leur découverte ; les autres cellules eucaryotes en ont cinq, dénommées α, β, γ, δ et ε. Après ses études de médecine, achevées en 1941 à Rochester University, Arthur Kornberg étudia l’enzymologie avec Severo Ochoa (New York University) et Carl F. Cori (Washington University School of Medicine, Saint Louis). En 1956, il rechercha dans des broyats d’Escherichia Coli des enzymes capables de catalyser la synthèse de polydésoxyribonucléotides à partir de désoxyribonucléosides triphosphate marqués au 32P. Il obtint une synthèse dans un milieu acellulaire auquel il avait ajouté des fragments d’ADN et, en 1958, il identifia une ADN polymérase d’Escherichia Coli (ADN polymérase I). En 1959 et 1960, trois autres groupes de chercheurs isolèrent des ADN polymérases de tissus animaux. Les membres du comité Nobel, qui avait mis près de dix ans pour comprendre l’importance de la découverte de la double hélice et récompenser leurs auteurs, essayèrent de corriger leur stupéfiante myopie et de couronner immédiatement la découverte des ADN et ARN polymérases. Kornberg publia en 1958 son article sur l’ADN polymérase I ; l’année suivante, il partagea le prix Nobel de physiologie ou médecine avec Severo Ochoa. Il faut savoir, pour la petite histoire, qu’Arthur Kornberg avait soumis plusieurs articles sur l’ADN polymérase au Journal of Biological Chemistry ; deux des plus importants furent rejetés par le comité de lecture dont faisait partie Erwin Chargaff. Il faut aussi savoir qu’Ochoa fut récompensé pour la découverte d’une ARN polymérase qui synthétisait des polyribonucléotides en l’absence d’une matrice d’ADN ( !) et qui se révéla plus tard être une ribonucléase !

John F. Cairns et Paula De Lucia (Cold Spring Harbor Laboratory) montrèrent que l’ADN polymérase I n’est pas l’enzyme responsable de la réplication de l’ADN des cellules bactériennes. La polymérase de Kornberg, ainsi que l’ADN polymérase II qui sera découverte plus tard, corrige les erreurs de réplication ou répare l’ADN endommagé par des agents chimiques ou physiques. L’enzyme qui catalyse la réplication du génome est l’ADN polymérase III. En présence d’une matrice d’ADN, elle ajoute des nucléotides à l’extrémité 3’OH d’un ADN – ou d’une amorce d’ARN – appartenant à un duplex. Reiji Okasaki (Nagoya University) démontra en 1968 que l’ADN polymérase III ne synthétise pas les deux brins d’ADN de la même manière (ce que l’on soupçonnait) : le brin dit « avancé » est édifié de manière continue, nucléotide par nucléotide ; le brin « retardé » est synthétisé par morceaux qui sont ensuite assemblés et liés entre eux par l’ADN polymérase I de Kornberg. Toutes les ADN polymérases ADN-dépendantes ont été isolées, cristallisées et leur structure tridimensionnelle a été établie. Toutes les protéines formant le complexe de réplication – qui porte le nom de réplisome – ont été caractérisées et isolées : facteurs d’initiation, qui reconnaissent les sites de démarrage du processus, primases (l’ADN polymérase commence la réplication à partir d’un « primer » d’ARN synthétisé par une ARN polymérase), hélicases et topoisomérase, qui déroulent les brins de la double hélice en se déplaçant le long de l’ADN en consommant de l’ATP, protéines SSB (Single Strand Binding Proteins chez les bactéries) ou RPA (Replication Protein A chez les eucaryotes et les archées) qui fixent les brins monocaténaires d’ADN pour les empêcher de s’enrouler, ligases qui suturent entre eux les fragments d’ADN, etc…

Colinéarité

Au début de ce paragraphe un bref rappel historique est nécessaire : c’est en 1953 que l’on comprit que les protéines sont des arrangements linéaires d’acides aminés et que chaque type de protéine possède une séquence unique et caractéristique. Cette année là, Frederick Sanger (Department of Biochemistry, Cambridge University et Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council) établit la séquence des 51 résidus d’acides aminés des deux chaînes de l’insuline de bœuf (la publication date de 1955). La séquence des 124 résidus d’acides aminés de la ribonucléase fut complétée à la fin des années 1950 par Stanford Moore et William H. Stein (Rockefeller University) et par le groupe de Christian B. Anfinsen (Harvard Medical School). Vers le milieu des années 1950, prit forme le concept de colinéarité qui est essentiel pour comprendre, et le rapport existant entre gène et enzyme, et le mécanisme de la transcription (la copie de l’ADN génomique en ARNm) : l’ordre des bases nucléotidiques dans la séquence du gène dicte l’ordre des acides aminés dans la séquence de la protéine codée par ce gène.

Au début des années 1960, le généticien Charles Yanofsky (Stanford University) démontra que, chez les bactéries, la séquence des bases dans un gène et celle des acides aminés dans la protéine codée par ce gène sont colinéaires. Il prit comme sujet d’études la chaîne α de la tryptophane synthase, un enzyme de la voie biosynthétique du tryptophane, un acide aminé essentiel pour Escherichia coli. Pour localiser la position des acides aminés affectés dans les formes mutées de tryptophane synthase, Yanofsky utilisa la technique du fingerprinting mise au point par Vernon M. Ingram (Cavendish Laboratory, University of Cambridge). La chaîne α (268 résidus d’acides aminés) fut soumise à une digestion protéolytique ; les peptides libérés furent séparés par électrophorèse sur papier ou par chromatographie. La substitution d’un acide aminé par un autre se traduit par un changement de position sur le chromatogramme du peptide renfermant cet acide aminé.

Pour déterminer la position des bases mutées, Yanofski et ses collaborateurs établirent une carte transductionnelle du gène en adoptant la technique de recombinaison génétique mise au point, en 1946, par Joshua Lederberg et Edward Tatum (Yale University). J’en rappelle brièvement le principe : des bactéries Escherichia coli « mâles » font passer de l’information génétique en transférant physiquement leur chromosome (ou un chromosome auxiliaire appelé plasmide) dans des bactéries « femelles » de souche différente. Ce transfert d’information génétique peut être interrompu en divers points du gène. Il suffit de soumettre la suspension de bactéries à un traitement mécanique qui a pour effet de rompre la portion de chromosome située entre la bactérie mâle et la bactérie femelle. Mise dans des conditions de culture ad hoc, les gènes portés par les fragments de chromosomes transférés dans la bactérie réceptrice sont exprimés. En espaçant judicieusement les traitements mécaniques, on peut jalonner le transfert d’un chromosome morceau par morceau et même gène par gène. Yanofsky montra la correspondance existant entre les mutations dans la séquence du gène de la tryptophane synthase (chaîne α) et des changements dans la séquence d’acides aminés.

Lorsque parut, en 1967, dans les Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, l’article de Yanofsky et ses collaborateurs intitulé « The complete aminoacid sequence of the tryptophan synthase a protein (alpha subunit) and its colinear relationship with the genetic map of the a gene », les résultats obtenus par Vernon M. Ingram, John A. Hunt et Anthony O.W. Stretton (Cavendish Laboratory, University of Cambridge) suggéraient une colinéarité entre gène et protéine chez les mammifères. Ingram, surnommé « The father of Molecular Medicine », avait entrepris en 1955 l’étude de la drépanocytose ou anémie à cellules (hématies) falciformes, une maladie assez répandue parmi les populations antillaises, africaines, indoues, ou vivant au Moyen-Orient et autour du bassin méditerranéen. Ingram montra que cette pathologie est causée par la substitution d’un seul acide aminé dans la séquence de la chaîne β de l’hémoglobine : un glutamate est remplacé par une valine. Ingram, soutenu et conseillé par Max Perutz et Francis Crick, mit cette anomalie en relation avec une mutation dans la séquence du gène.

Intermédiaires : ARN messager et ARN de transfert

En 1954, un an après la publication de Watson et Crick sur la structure en double hélice de l’ADN, le physicien Gueorgui A. Gamov (George Washington University), inventeur avec le chanoine Georges Lemaître de la théorie du Big Bang, imagina un mécanisme d’expression des gènes selon lequel l’ADN serait une matrice sur laquelle le polypeptide s’édifie directement, acide aminé par acide aminé, comme sur un moule. Dans le gène, le « code » de sélection de l’acide aminé serait constitué de triplets de nucléotides qui pourraient se chevaucher. Dans ce modèle, l’interaction entre nucléotides et acides aminés serait directe, ceux-ci venant se loger dans des poches de la double hélice en face de leur triplet. Francis Crick s’inspira de l’hypothèse de Gamov mais écarta la possibilité d’une interaction directe entre acides aminés et ADN. Les chromosomes étant localisés dans le noyau et les ribosomes dans le cytoplasme, il devait exister au moins un intermédiaire entre le gène et la machinerie de synthèse protéique. La même année, en 1954, Francis Crick et Sidney Brenner postulèrent l’existence d’un ARN intermédiaire, un « adaptateur » portant l’acide aminé ; chacun des 20 acides aminés aurait son adaptateur spécifique.

En 1956, Mahlon B. Hoagland et Paul C. Zamecnik isolèrent à partir de la fraction soluble d’extraits acellulaires deux facteurs, l’un sensible et l’autre résistant à la chaleur. Ce dernier facteur correspondait à un ARN de petite taille, d’abord baptisé « ARN soluble », puis « ARN de transfert » (ARNt). Cet ARN fixe spécifiquement, sur le ribose de son extrémité 3’, un acide aminé activé (par exemple l’alanine) en donnant un aminoacyl-ARNt (en l’occurrence l’alanyl-ARNt). Une fois chargé, il agit comme « donneur d’acide aminé » dans la réaction d’élongation de la chaîne peptidique sur le ribosome. Il existe 20 ARNt différents spécifiques de chaque acide aminé. En 1964, Robert W. Holley acheva la détermination de la première séquence d’un acide nucléique : celle de l’alanyl-ARNt de levure (76 nucléotides). Le facteur sensible à la chaleur détecté par Hoagland et Zamecnik fut identifié à l’aminoacyl-ARNt synthétase, l’enzyme qui catalyse la fixation d’un acide aminé sur son ARNt. Il existe aussi vingt aminoacyl-ARNt synthétases différentes. Ces enzymes sont d’une extrême sophistication : ils possèdent deux sites actifs séparés, l’un reconnaissant l’acide aminé et l’autre l’ARNt correspondant. En 1941, Fritz A. Lipmann et Hermann Kalckar avaient prédit que des intermédiaires phosphorylés devaient intervenir dans la synthèse protéique. Conformément à cette prédiction, la réaction catalysée par l’aminoacyl-ARNt synthétase nécessite l’apport d’une molécule d’ATP pour « activer » le résidu d’acide aminé en le transformant en amino-acyl adénylé, c’est-à-dire lié à une molécule d’AMP.

En 1956, Elliot Volkin et Lazarus Astrachan (Oak Ridge National Laboratory) effectuèrent une série d’expériences sur la bactérie Escherichia coli infectée par le bactériophage T2. Les procaryotes ne possédant pas d’enveloppe nucléaire, génome et machinerie de synthèse protéique coexistent dans le même compartiment cellulaire. Seymour Cohen avait montré que l’infection par le phage provoque une dégradation de l’ADN bactérien et l’arrêt de la synthèse protéique au profit de la synthèse des protéines du phage. Après l’infection, Volkin et Astrachan détectèrent l’apparition successive d’ARN (en grande quantité), puis d’ADN et enfin de protéines du phage (à elle seule, la synthèse de la protéine de la tête du phage représente environ 70% de la synthèse protéique totale). Ils établirent que cet ARN avait le même rapport des proportions de bases que l’ADN du phage T2. Volkin et Astrachan lui donnèrent le nom de « DNA like RNA ». Malheureusement pour Volkin et Astrachan, ils évoluaient à l’écart du groupe le plus actif des biologistes (futurs) moléculaires ; leurs résultats publiés dans Virology : « Phosphorus incorporation in Escherichia coli ribonucleic acid after infection with bacteriophage T2 » restèrent confidentiels, sauf pour Sidney Brenner (Department of Chemistry, Oxford University), membre du Tie Club de l’ARN fondé par Gueorgui Gamov et James Watson ; le « DNA like RNA » était un sérieux candidat au rôle d’intermédiaire dans l’expression du génome.

En 1961, cinq ans après la publication des résultats de Volkin et Astrachan, l’intermédiaire fut redécouvert presque simultanément par deux groupes de chercheurs : François Gros, Howard Hiatt et Walter Gilbert, dans le laboratoire de James Watson (Harvard University) et François Jacob, Sidney Brenner et Matthew S. Meselson (California Institute of Technology). François Jacob (Institut Pasteur, Paris) avait émis l’hypothèse d’un « intermédiaire « X », instable et à vie courte» au cours d’études qu’il effectuait avec Jacques Monod sur la β-galactosidase d’Escherichia coli. Cet enzyme, qui hydrolyse les β-galactosides comme le lactose, est « inductible ». Le génome d’Escherichia coli renferme une séquence de quatre gènes contigus (un « opéron ») qui permet à la bactérie d’utiliser le lactose comme source de carbone. C’est pendant la phase d’induction, au cours de laquelle la β-galactosidase est synthétisée de manière très active, qu’apparaîtrait l’intermédiaire X. Il fut isolé par trois groupes de chercheurs travaillant indépendamment, dont celui de Samuel Weiss, et baptisé ARN messager (ARNm). Ce fut probablement l’une des plus importante découverte en biologie moléculaire après celle de la double hélice.

« Breaking the genetic code » : Une épopée scientifique

En 1955, Severo Ochoa et Marianne Grunberg-Manago (New York University School of Medicine) avaient isolé un enzyme d’Escherichia coli synthétisant de l’ARN ; ils croyaient avoir affaire à l’« ARN polymérase » ; il s’agissait en réalité d’une polynucléotide phosphorylase synthétisant in vitro des polynucléotides en l’absence de matrice, tandis que l’ARN polymérase ne synthétise de l’ARNm qu’en présence d’une matrice d’ADN. On a depuis montré qu’in vivo l’enzyme de Grunberg-Manago et Ochoa est une ribonucléase, c’est à dire un enzyme qui dégrade l’ARN en hydrolysant les liaisons entre ribonucléotides. Cela n’empêcha pas Ochoa de partager avec Arthur Kornberg le prix Nobel de médecine ou physiologie, en 1959, « for the discovery of an enzyme in bacteria that enabled to synthesize a polynucleotide of ribonucleic acid ».

Pour vérifier l’hypothèse de l’ARNm, Johann H. Matthaei et Marshall W. Nirenberg (National Institute of Health, Bethesda) mirent au point un système de synthèse protéique in vitro à partir d’un extrait d’Escherichia coli traité par la ribonucléase pour détruire les ARN présents dans le milieu, à l’exception des ARNr protégés par leur association aux protéines ribosomiales. L’extrait acellulaire fut programmé avec un ARN viral (facile à préparer) et additionné d’un mélange des vingt acides aminés, dont l’un était marqué par un isotope radioactif. En parallèle, Matthaei et Nirenberg firent une « expérience témoin » dans laquelle l’ARN viral était remplacé par un ARN synthétique, un polyuridylate (UUUUUUUUU…) obtenu en incubant la polynucléotide phosphorylase en présence d’uridine. Ils eurent la surprise de constater que le système avait synthétisé un polypeptide constitué de phénylalanine (F-F-F…). Pour la première fois, une correspondance entre une séquence ribonucléotidique et un acide aminé fut mise en évidence. Cette découverte date de 1961. Trois ans plus tard, Nirenberg et Philip Leder montrèrent que les ribosomes d’Escherichia coli incubés en présence de polyU fixent le phenylalanyl-ARNtPhe à l’exclusion de tout autre aminoacyl-ARNt. Avec toujours la même méthodologie, il fut établi que le polycytidilate (CCCCCCCCC…) programme la synthèse in vitro de polyproline (P-P-P…), le polyadénylate (AAAAAA…), de polylysine (Y-Y-Y…).

Une question restait en suspens : quel est le nombre de bases ribonucléotidiques nécessaires pour spécifier un acide aminé ? Une seule était un nombre insuffisant puisqu’il n’y a que quatre bases différentes. Deux bases ne permettaient que 16 combinaisons possibles pour 20 acides aminés naturels [8]). Si le code est constitué de triplets, comme l’avait suggéré Gueorgui Gamov et, après lui, Francis Crick, il y a des redondances : 64 combinaisons possibles pour 20 acides aminés, et un acide aminé peut être spécifié par plusieurs triplets. La solution du problème fut obtenue par deux approches expérimentales différentes.

La protéine d’enveloppe du virus satellite du virus de la nécrose du tabac est une protéine oligomérique. Chaque sous-unité renferme 400 résidus d’acides aminés, et l’ARN correspondant, 1.200 ribonucléotides. Francis Crick et Sidney Brenner modifièrent le génome du bactériophage T4 d’Escherichia coli. La description du protocole expérimental nécessiterait un long développement ; il est décrit de manière didactique dans l’édition de 2004 du manuel de biochimie de Donald et Judith Voet (Biochemistry, 3rd edition, John Wiley & Sons, page 896). En bref, il s’agissait de mutations « frame shift » (déplacement du cadre de lecture) consistant en l’insertion ou la délétion d’un nucléotide dans le gène de la protéine d’enveloppe, transformant les codons situés en aval de la mutation en « codons non-sens », c’est à dire ne spécifiant aucun acide aminé. En jouant sur une série de combinaisons (une insertion, une insertion et une délétion, etc) et sur le nombre de mutations (1,2, ou 3), Crick et Brenner parvinrent à la conclusion que le code se lit par triplets : chaque codon est formé de triplets de bases ribonucléotidiques.

L’hypothèse du triplet fut confirmée par le résultat des expériences de synthèse protéique in vitro d’Har Gobind Khorana (The University of Wisconsin, Madison puis Massachusetts Institute of Technology). Durant ses études post-universitaires, Khorana avait été formé par de bons maîtres. Il avait étudié la chimie dans sa province natale du Punjab, qu’il quitta lorsqu’elle passa sous juridiction pakistanaise après la partition du sous-continent indien. Il acquit un PhD en chimie organique à l’Université de Liverpool, séjourna à Zurich dans le laboratoire de Vladimir Prelog (prix Nobel de chimie en 1975) et accomplit un stage post-doctoral à Cambridge où il assista à l’émergence de la biologie moléculaire : Frederick Sanger achevait la séquence de l’insuline et Max Perutz publiait la structure tridimensionnelle de la myoglobine. Il séjourna dans le laboratoire d’Alexander R. Todd, spécialiste de la chimie des nucléotides, et qui fut à deux doigts de résoudre la structure de l’ADN.

Khorana synthétisa des polyribonucléotides formés, non pas d’une seule base comme dans les expériences de Nirenberg et Leder, mais d’une alternance de deux bases (UCUCUCUCU…), de trois bases (AUGAUGAUG…), ou de quatre bases… Les polyribonucléotides, amplifiés par l’ARN polymérase (Khorana inventa la Polymerase Chain Reaction avant la lettre !), fournissaient une quantité suffisante d’ARNm pour programmer un système de synthèse protéique in vitro. Les polypeptides synthétisés étaient isolés et séquencés et les séquences, du polyribonucléotide d’une part, et du peptide d’autre part, étaient comparées. Khorana confirma l’existence d’un code génétique composé de triplets (codons) ; il identifia les codons de la sérine (UCU) et de la leucine (CUC) et découvrit les codons STOP interrompant la traduction : UAG, UAA et UGA. Pour le déchiffrage complet des 64 triplets (ou codons) du code génétique, Khorana se lança dans la synthèse de polydésoxyribonucléotides dont la taille s’allongea jusqu’à atteindre celle de mini-gènes. Il recourut à la chimie en milieu non-aqueux combinée à l’utilisation de polymérases et de ligases. Le déchiffrage complet du code génétique fut achevé en 1966.

En 1972, Walter Fiers et ses collaborateurs (Universiteit Gent, Belgique) apportèrent une preuve directe que la machinerie de transcription et de synthèse protéique lit le code génétique de manière séquentielle et par triplets. Le génome du bactériophage MS2 est un ARN. La protéine d’enveloppe du virus est un polypeptide de 128 résidus d’acides aminés. Fiers établit la séquence nucléotidique complète du gène de la protéine d’enveloppe et la compara à celle du polypeptide. Les deux séquences étaient parfaitement alignées et chaque triplet du gène disposé dans le même ordre que l’acide aminé correspondant. En 1976, Khorana parvint à un résultat similaire après avoir synthétisé un gène et comparé sa séquence à celle du polypeptide obtenu par transcription et traduction in vitro. En 1968, Khorana partagea avec Marshall Niremberg et Robert Holley le prix Nobel de physiologie ou médecine.

ARN polymérases

En 1959, Samuel B. Weiss (Department of Biochemistry, University of Chicago) mit en évidence dans les noyaux de foie de rat un enzyme catalysant l’incorporation de ribonucléosides triphosphate (ATP, UTP, GTP, CTP) marqués dans de l’ARN. Cette réaction diminuait si l’un des quatre nucéotides était absent dans le milieu. Le produit formé était sensible à la RNAse et libérait les nucléotides marqués par hydrolyse alcaline. La réaction était peu affectée par l’addition de DNAse au milieu. En 1960, Jerard Hurwitz (New York University School of Medicine) isola, à partir d’Escherichia Coli, un enzyme répondant à tous les critères requis : synthèse d’ARN seulement en présence des quatre nucléotides dans le milieu ; stimulation de l’incorporation de nucléotides marqués après addition d’ADN de différentes sources ; inhibition par l’addition de DNAse ou de RNAse. En 1961, furent publiés deux articles (en plus de celui de Samuel Weiss) sur la synthèse d’ARN in vitro : Audrey Stevens, une étudiante post-doctorale du laboratoire de Leon Heppel (National Institue of Health, Bethesda) décrivait la présence, dans des extraits d’Escherichia Coli, d’un enzyme incorporant de l’ATP marqué dans de l’ARN en présence des quatre nucléotides ; l’activité détectée était sensible à la RNAse ; James Bonner (California Institute of Technology) décrivait la présence d’une activité similaire dans des extraits de pois. En 1961, Samuel Weiss et Tokumasa Nakamoto isolèrent l’ARN polymérase ADN-dépendante de Micrococcus lysodeikticus et s’efforça et démontrèrent que l’ARN synthétisé avait la même composition en paires de nucléotides que l’ADN ayant servi de matrice.

Les cellules procaryotes possèdent une ARN polymérase ; les cellules eucaryotes en ont trois : l’ARN polymérase I (ARN-pol I) qui transcrit les gènes d’ARNr à l’exception de l’ARNr 5S ; l’ARN polymérase II (ARN-pol II) qui transcrit les gènes d’ARNm et ceux d’ARN nucléaires de petite taille (ARNsn, pour small nuclear) ; l’ARN polymérase III (ARN-pol III) qui transcrit les gènes des ARNt et de l’ARNr 5S. L’ARN polymérase ADN-dépendante est un complexe enzymatique dont l’activité (la « transcription » selon le terme proposé par Saul Spiegelman et M. Hayashi) est hautement régulée par des facteurs de transcription.

La fin des années 1950 et le tout début des années 1960 furent marquées par le déchiffrage du code génétique et par la découverte de l’ADN polymérase I et de l’ARN polymérase ADN-dépendante. En 2006, Roger Kornberg (Stanford University), le fils d’Arthur Kornberg, reçut le prix Nobel de chimie pour l’élucidation du mécanisme d’action de l’ARN polymérase à l’échelle atomique.


  1. Chez les Vertébrés, les globules rouges sont des cellules nucléées, à l’exception de ceux des Mammifères.
  2. Le carbone C1’ du pentose est lié aux bases (à l’azote N1 des pyrimidines et à l’azote N9 des purines) ; le carbone C4’ participe à la formation de l’anneau désoxyribofuranosique ; les carbone C3’ et C5’ à la formation de la liaison phosphodiester entre pentoses adjacents (2’-désoxyribose pour l’ADN, ribose pour l’ARN).
  3. Rudolf Signer, Torbjörn O. Caspersson, Einar Hammarsten. Molecular Shape and Size of Thymonucleic Acid. Nature, 1938, 141, 122.
  4. James D. Watson. The Double helix. A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA. Athenaeum. New York. 1968.
  5. Des circonstances analogues ont entouré bien d’autres découvertes sans que cela ne remette fondamentalement en cause le mérite des scientifiques impliqués ; cela les recadre simplement dans leur dimension humaine.
  6. James D. Watson, Francis H. Crick. Molecular Structure of Nucleic Acids ; a Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature, 1953, 171, 737.
  7. James D. Watson, Francis H. Crick. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature, 1953, 171, 964.
  8. Aux 20 acides aminés naturels, présents dans les protéines, on ajoute maintenant deux acides aminés rares.